2014 Fiscal Year Research-status Report
DINE欠損運動神経の骨格筋支配における発生学的異常の解析
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26860141
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
永田 健一 独立行政法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 基礎科学特別研究員 (50587798)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DINE / ECEL1 / 神経筋接合部 / 関節拘縮症 / 運動神経 / 軸索分岐 / ノックインマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は先天性関節拘縮症の原因遺伝子DINE（ECEL1）の働きを特に運動神経の発達過程に着目して解析することである。運動神経特異的にGFPを発現するHb9::GFPトランスジェニックマウスとの交配により、DINEノックアウトマウスの全身の運動神経を可視化した。上肢、下肢の運動神経の発達過程を詳細に追跡したところ、上肢ではE13.5から、下肢ではE14.5からDINE欠損運動神経の分岐の減少が認められた。発達が進んだE17.5の下肢で、10種類以上の運動神経の分岐を定量的に評価したところ、半数以上で分岐数が著しく低下していることが明らかとなった。また、運動神経の筋内分岐数の低下に伴い神経筋接合部の形成も乏しくなっていた。
DINEのヒトホモログECEL1への変異は先天性関節拘縮症を引き起こすことが知られている。1塩基のみの置換でも疾患を発症することが報告されているが、特定の1塩基置換がDINEの働きにどのように影響するのかは明らかでない。本研究では、病原性の1塩基置換の機能的影響を明らかにするため、1塩基置換変異を導入したDINEノックインマウスの作製を計画した。ノックインマウスの作製はゲノム編集技術の１つであるCRISPR/Cas9システムを用いた。培養細胞を使ってシステムが機能することを確認した上で、CRISPR/Cas9システムのRNAを合成し、適切な変異の入ったオリゴDNAとともにマウス受精卵にインジェクションした。仮親に胚を戻し、生後3週齢の時点でジェノタイピングを行った。1塩基置換が正しく挿入されている個体は性成熟を待って野生型マウスと交配し、次世代に変異が引き継がれるか、を調べた。これまでに複数系統の作製に成功していることが確認できている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
DINEノックアウトマウスの上肢、下肢での運動神経の解析が計画通りに順調に進んでおり、必要なデータを取り終えた状態にある。また、ゲノム編集技術を利用したノックインマウスづくりは初めての試みであったが、当初の計画以上に順調に作製が進み、次年度に予定していた一部の実験まで既に終了している。
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| Strategy for Future Research Activity |
作製したノックインマウスの運動神経が異常を示すかどうか、運動神経を可視化し検証する。運動神経の可視化は運動神経特異的にGFPを発現するHb9::GFPトランスジェニックマウスとの交配により行う。複数系統のノックインマウスが存在するため、異なる変異を有する系統間で表現型を比較し、その違いを明らかにする。
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