遺伝学的組織操作による泌尿生殖器官発生研究: 肛門直腸奇形発症メカニズムの解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860196
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 松丸 大輔 和歌山県立医科大学, 先端医学研究所, 学内助教 (50624152)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 総排泄腔 / 尿直腸中隔 / 3Dイメージング / 肛門直腸奇形

Outline of Annual Research Achievements

泌尿生殖器官は、胎児期に一過的に存在する総排泄腔が尿直腸中隔（Urorectal septum: URS）によって尿生殖洞と後腸に分割されることによって形成される。総排泄腔の分割不全は、肛門直腸奇形（Anorectal malformation: ARM）と呼ばれ、出生児の数千人に１人という高頻度で発症する。多数の知見の積み重ねがあるにも関わらず、正常な総排泄腔の分割過程に関わるメカニズム、またARMの発生機序に関して現在まで議論が続いている状況である。本研究課題は、マウス遺伝学的手法、またイメージング技術を駆使して総排泄腔分割に関わるメカニズムを明らかにすることを目的としている。平成26年度は、マウス遺伝学的手法を用いたURS間葉細胞の系譜解析を行なった。胎齢10.5日で形成されつつあるURS間葉全体を標識し、一日後の胎齢11.5日において矢状断切片を作製し解析したところ、URS間葉細胞の一部は胎齢10.5日におけるURS間葉細胞以外の細胞に由来することが示唆された。そこでURSの全体構造の把握のために、連続切片の3D再構築、免疫染色サンプルの共焦点顕微鏡解析といったイメージング解析を行なった。総排泄腔上皮の構造変化を解析したところ、URSは胎齢10.5日から総排泄腔上皮の折り畳みとして確認されはじめ、胎齢11.5日にかけて尿生殖洞側の扁平化と後腸側の狭窄化を伴いながら大きく総排泄腔分割が進むことが明らかとなった。そして三次元解析と連続切片を用いた解析から、URSという構造物は独立した胎児組織としては存在せず、尿生殖洞と後腸の間葉組織を矢状断切片で観察することから観られる構造であるという結論に達した。この知見は、従来のURS依存型の考え方とは一線を画すものであり、さらなる解析により新規総排泄腔分割メカニズムの提唱につながるものであると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、前年度延長申請した研究課題の影響のため本研究課題の遂行にかける時間が予定よりも少なかった。しかし、従来は組織学的手法（二次元的解析）を主に用いて解析されていた総排泄腔分割過程を三次元的手法を用いて可視化し、URSの独立構造としての存在そのものに疑問を投げかける新規知見を得ており、研究自体の推進状況は芳しいものであると判断される。研究実施計画としてはイメージング解析に加え、細胞除去実験も行なう予定であったが、上記理由とURS構造そのものの存在に関して疑問が生じている状況であるため、複合遺伝子改変マウスを準備する段階に留まっており、平成27年度にCre組換え酵素発現マウスの再検定を行なってから本格的解析に移りたいと考えている。本課題のもう１つの推進項目であるURS形成に関わる細胞増殖因子シグナルカスケードの解析に関しては、本課題の開始直後に一部を論文として発表しており、本年度得られた知見を踏まえた三次元的な解析を進めていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度の成果として、URS構造は独立した胎児構造としては存在せず、周辺組織の間葉が管腔の分割をする構造のように見えている可能性を示唆した。これは当初の研究実施計画では予期しなかった知見であるため、平成27年度はこの考え方に沿った解析に移行する必要があると考えられる。具体的には、遺伝子改変マウスの解析も含め従来は組織学的手法を用いた二次元の解析が主であったが、これをイメージング技術を用いた三次元解析で行なう。つまり、遺伝子発現や遺伝子改変マウスの表現型解析に関して、組織再構築の手法や共焦点顕微鏡を用いた三次元的な解析を中心的手法として行う。また、総排泄腔上皮内の細胞の挙動を解析するため、スライスカルチャー系を用いる予定であったが、共焦点顕微鏡を用いた器官培養系での解析に切り替える予定である。URS形成過程が胎齢10.5日から12-24時間程度という短時間で大きく進むため、組織培養でも分割現象を観察することができると予想される。ジフテリアトキシン発現マウスを用いた組織特異的細胞除去実験は、実験の計画段階でURS間葉発現性Creマウスと考えていたGli1-CreERT2マウスを用いた系では不十分である可能性があるため、Cre発現マウス系統の再検討を行なう予定である。共焦点顕微鏡を用いた三次元的解析においては、その焦点距離や光の透過性等の問題から、サンプルサイズのかなり小さいものに限定される可能性が考えられるが、昨今のサンプル透明化技術（BABB法やScale法）を用いて対応することを考えている。また、最新のイメージング機器（2光子励起顕微鏡やOptical projection tomography）を使用することも視野に入れる。

Causes of Carryover

本年度は、前年度延長申請した研究課題の影響により本課題の遂行のための時間が予定よりも少なかった。このため、受託解析やデータ分析のための支出が少なく、学会での成果発表も見送ったことにより未使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本研究課題では、主としてマウスを用いた個体レベルでの解析を行なうため、マウス飼育経費を計上する必要がある。飼育費用として約80ケージを一年間維持するためには50万円程度の費用が必要となる。また、マウス個体の遺伝型識別や組織解析のための酵素、抗体類の購入と、手術や個体サンプルの保存に用いるプラスチック器具類、組織培養に必要となる試薬類の購入を予定している。
三次元的解析は、主としてwhole-mount状態での免疫組織化学染色を行なうことを計画している。本手法での染色には一次抗体、二次抗体共に通常より多量の抗体を使用するため、抗体の購入費用をより多く計上する。また、情報収集及び研究成果のための国内学会参加旅費2件、国際学会参加旅費1件を予定しており、平成27年度中に研究成果論文投稿を予定している。

Research Products

• [Journal Article] T396I Mutation of Mouse Sufu Reduces the Stability and Activity of Gli3 Repressor. (2015)
  • Author(s): Makino S, Zhulyn O, Mo R, Puviindran V, Zhang X, Murata T, Fukumura R, Ishitsuka Y, Kotaki H, Matsumaru D, Ishii S, Hui CC, Gondo Y.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 10 Pages: e0119455
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0119455
  • Peer Reviewed / Open Access