Toll様受容体4複合体を介した自然免疫の機能におけるコアフコースの意義

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860201
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 飯島 順子 独立行政法人理化学研究所, 疾患糖鎖研究チーム, 訪問研究員 (10559636)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 糖鎖生物学

Outline of Annual Research Achievements

「TLR4複合体におけるコアフコース糖鎖の機能の解明」を切り口に「自然免疫における糖鎖の機能」の理解することを目的とした。

TLR4は 細胞膜上でMD2と複合体を形成し、グラム陰性菌の細胞壁成分であるLipopolysaccharide(LPS)を認識することでそのシグナルを伝え、炎症性サイトカインの分泌を促す。これまでの培養細胞を用いた実験で、コアフコース欠損時ではTLR4,MD2が細胞表面に正常に発現し、且つTLR4-MD2複合体を形成するにも関わらず、LPS刺激時においてそのシグナル伝達が抑制されることが分かった。LPS刺激後のTLR4-MD2複合体の動態を経時的にフローサイトメトリーで観察したところ、Fut8を欠損した細胞ではLPS刺激にも関わらずTLR4-MD2複合体が細胞表面上に保持される傾向が観察された。このことから、Fut8欠損時ではTLR4-MD2複合体はLPSとの結合が抑制され、結果、正常なLPSシグナル伝達が抑制されることが示唆された。

次に、Fut8欠損マウスのマクロファージを用いたin vivoでの解析の系を立ち上げた。Fut8欠損マウスは胎生致死であり生体内でFut8欠損マクロファージの機能を検討することが不可能である。そこで、Fut8欠損マウスの胎児肝細胞由来マクロファージをドナーとし、マクロファージを欠損したレシピエントマウスに移植することでマクロファージキメラマウスを作製、LPSに対する血中炎症性物質の産生を調べることで生体内におけるコアフコースによるTLR4機能制御の役割を解明を目指した。すでに、生体内においてマクロファージを欠損させる試薬であるクロドロン酸をマウスに投与することで、体内で一時的にマクロファージを欠損させることに、また、マウス胎児肝細胞を分離し、マクロファージに分化させることに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

N型糖鎖はタンパク質の正常な構造形成に重要である。その為、コアフコースの欠損によりTLR4やMD2に構造異常が生じてTLR4-MD2複合体の形成が阻害されることが考えられた。このことを確認するには、野生型とFut8欠損細胞を用いてTLR4とMD2に対する免疫沈降を行い、互いの共沈殿により複合体形成を確認する必要があった。これらを目的に培養細胞でTLR4,MD2を発現するベクターの作製を行い、各種タグを用いた免疫沈降によってTLR4とMD2の複合体の形成を確認することができた。更に、これらベクターを用いてのTLR4,MD2のFACS解析の系を立ち上げたことで、コアフコースの有無に関わらずTLR4-MD2複合体が細胞表面に正常にリクルートされることが確認できた。
加えて、Fut8を欠損したマウス胚性線維芽細胞を用いて細胞表面上のEndogenousなTLR4-MD2複合体の発現をフローサイトメトリーで確認できたことで、発現ベクターを用いた強制発現系とは異なる、より細胞本来の機能に近い状態での解析が可能になり、LPS刺激後の複合体の経時的な動態をフローサイトメトリーで観察することでFut8の有無でLPSに対するTLR4-MD2複合体の反応性が明らかになった。
これらの結果により、さらに27年度において、コアフコースがTLR4の機能制御に及ぼす役割を詳細に追うことが可能になったと考える。

また、クロドロン酸投与によって一時的なマクロファージ欠損マウスの作製、且つ胎児肝細胞由来マクロファージの培養に成功したことで、27年度において上記系を用いたマクロファージキメラマウスの作製と解析が可能になった。

Strategy for Future Research Activity

26年度において、Fut8欠損時にTLR4,MD2が細胞表面に正常に発現し、且つTLR4-MD2複合体を形成するにも関わらず、LPS刺激に対する反応が抑制されることが分かった。この結果よりコアフコースが付加されない場合はTLR4-MD2複合体にLPSが正常に結合できない可能性が考えられるため、フローサイトメトリーや免疫沈降にてこの仮説を検証する。また、TLR4-MD2複合体がLPSの受容体として働くには、まず先にLPSをTLR4-MD2複合体に運搬するCD14が必要となる。そのため、LPS刺激に対するCD14の動態をフローサイトメトリーにより観察する。
更に、通常ではLPS刺激時にはTLR4-MD2複合体同士が結合し二量体を作るため、Fut8が欠損した細胞で二量体の形成が正常に行われているかをタグを用いた免疫沈降法により同時に調べる。このようにコアフコースがTLR4の機能制御に関わるメカニズムを解析する。

また、26年度にマウス個体にマクロファージを欠損させる試薬であるクロドロン酸を投与することにより、一時的にマウス体内のマクロファージを欠損させることに成功した。Fut8欠損マウスは胎生致死であるが、マウス胎児肝臓より幹細胞を採取し、マクロファージへの分化誘導、培養を行うことで、Fut8欠損マクロファージを用いた実験が可能になった。このFut8欠損マクロファージを、クロドロン酸投与により体内マクロファージを欠損させたマウスに移植することで、Fut8欠損マクロファージを体内にもつ持つマクロファージキメラマウスの作製が可能になった。このマクロファージキメラマウスにLPSを特異的に腹腔内投与したのち、血中の炎症性サイトカインの分泌を測定することで、マウス体内でコアフコースがTLR4の機能に及ぼす影響を検討する。

Causes of Carryover

大阪大学に維持されていた研究室の閉鎖と移動、和光の理化学研究所での再セットアップのために、一時的に実験を中断する必要があったため。
また、次年度の雇用の有無により実験の継続が可能か不明であったため、継続的な維持を必要とする動物実験を行うことが難しく、生化学に特化して実験を行ったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

和光の理化学研究所でのセットアップにより動物実験を行う環境が整ったため、前年度にできなかったマウスの解析に使用する。