自己免疫疾患関連遺伝子IкBLによって制御される全選択的スプライシング産物の解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860225
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 櫻井 大祐 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教 (30382964)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: スプライシング調節因子 / 全転写産物発現解析 / 新規アイソフォーム

Outline of Annual Research Achievements

実施計画に基づき、培養T細胞株であるJSL-1株を使い、IonTorrentPGMを用いてRNA-seqをおこなった。概要は以下の通り。
1. 野生型のJSL-1株およびPMA刺激をおこなった野生型JSL-1株、IκBL強制発現JSL-1株ならびにPMA刺激をおこなったIκBL強制発現JSL-1株からmRNAを精製しシークエンス解析を実施。それぞれ3～5回のシークエンス解析をおこなう事で、約1000万リード数以上の転写産物のシークエンスを得る事ができた。
2.先行研究で選択的スプライシングのパターンが変化することがわかっている、CTLA4、CD47、CD72に関して詳細な解析をおこなった所、再現性のある結果が得られた。また過去の報告で野生型のJSL-1株とPMA刺激JSL-1株をRNA-seq比較した研究があるが、そのデータとの再現性も確認されたため、本実験系の妥当性は担保された。
3.上記先行研究との比較により、IκBLによって制御されるアイソフォームの存在が複数確認された。またIκBLによって制御されるこれまで未報告の選択的アイソフォームの存在が複数確認された。以上の結果は定量的RT-PCRでその検証をおこなった。
これらの結果からIκBLは1000個以上の遺伝子発現を制御し、また400以上の選択的スプライシングを誘導し、そのうち50以上のものに関しては未報告の選択的アイソフォームであった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

取り扱うデーター量が膨大で、次世代シークエンサー専用解析ソフトウェアに、選択的スプライシングアイソフォームに注目して解析を行うツールが搭載されていない為、当初の予定にくらべるとデーター解析に遅れが出ている。またその影響の為、形質転換B細胞株を用いたRNA-seqは実施できていない。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度の研究計画中で、遅れが出ているものに関しては速やかに研究を進める。
平成27年度の研究計画でおこなう予定だったゲノム編集を用いたノックインマウスの作成とその表現型の解析は規模を縮小する。

次世代シークエンサー解析ソフトウェアはニーズに合わせて他社のものを使用することも検討する。