乳癌の浸潤・転移における非線維性コラーゲンのタイプ別の役割の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860241
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 塩見 浩介 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70508043)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: コラーゲン / 乳癌 / 線維芽細胞 / 非線維性コラーゲン

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、乳癌組織で見られる分子状態（結果）へ至る道筋をin vitroで追うことを目標とし、研究を進めた。乳癌細胞株（MCF-7, MDA-MB-231）および乳癌組織由来線維芽細胞（Hs742-TF）について、様々な培養条件下における細胞特性（形態、運動、分子的な特徴）について解析を行った。本研究の発露は、プロテオーム解析により、浸潤癌間質で12型コラーゲンの、非浸潤癌間質で14型コラーゲンの特徴的な発現が見られたことである。本年度は、乳癌細胞‐間質細胞間の作用に注視し研究を進めた。乳癌細胞のコンディション培地を用いたHs742-TFの培養を行った結果、両コラーゲンの発現が若干減少した。プロテオーム解析の結果、浸潤‐非浸潤癌間質間で発現差が確認できた他の遺伝子（FN1, DCNなど）を被作用の指標とし、幾通りかの培養条件における解析を行っている。間質細胞におけるコラーゲン発現とその乳癌細胞への影響を解析する。まずshRNAにより12型、14型コラーゲン発現をノックダウンしたHs742-TFを作成した。遺伝子導入は、レトロウイルスを用い、ノックダウンの可否は、培養培地を用いたドットブロット法により確認した。12型、14型コラーゲンは線維性コラーゲンと共存することで機能性を発揮するとされている。そこで、1型コラーゲン包埋培養時の乳癌細胞に対する間質細胞からの作用を調べることにした。乳癌細胞はスフェロイドの形状で包埋培養を行うこととしたため、まずスフェロイドの形成条件を決定した。包埋培養環境下へのHs742-TF培養培地の単純添加の有無では乳癌細胞スフェロイドの振る舞いに差はなかった。現在、様々なHs742-TF培養培地の回収条件、添加条件での解析を行っている。加えて、添加培地中の12型、14型コラーゲン発現の有無による乳癌細胞への影響を調べている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当年度は、既存細胞株および、作成したノックダウン細胞株を用いて、線維芽細胞‐乳癌細胞間の相互作用についてのin vitroでの解析を行った。本解析からは今のところ明瞭な結果は得られてはいないが、今後の解析の足掛かりを得られたと考えている。一方、予定していた、12型、14型コラーゲン過剰発現（線維芽）細胞の作製は、cDNA塩基長が大きく変異修正に時間がかかりすぎるため中止し、ノックダウン細胞での解析を行うことにした。また、ヌードマウスへの移植実験についても、移植予定であった細胞の作製を中止したことにより実施しなかった。全体の達成度としては６割程度であると考えている。

Strategy for Future Research Activity

これまで、乳癌組織由来の線維芽細胞を用いて、間質系細胞におけるコラーゲン発現と乳癌細胞の関係性をin vitroで解析してきた。今後は、新たに準備した正常乳腺由来線維芽細胞においても同様の目的で解析を行っていく。解析については、主として形態、行動観察を行い、分子的なアプローチとして、qPCRによる発現解析、アレイ解析を予定している。また、コラーゲンをノックダウンした線維芽細胞と乳癌細胞のヌードマウスへの共移植により、コラーゲン環境と癌浸潤の関係性を調べていきたい。

Causes of Carryover

当初、ヌードマウスへの細胞移植実験を予定していたが、使用予定であった細胞の作製を中止したことにより、当該実験をとりやめたため、追加したin vitroでの解析に必要となった物品との価格差により次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

前年度に予定していたヌードマウスへの移植実験を、使用細胞を変更してとり行う。また、細胞外のコラーゲン環境による乳癌細胞への影響についてアレイ等による発現解析を行おうと考えている。