2015 Fiscal Year Research-status Report
感染応答時にmRNPで翻訳調節を受ける宿主遺伝子の網羅的同定
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26860256
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
瀬戸 絵理 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40431382)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 感染応答 / P-body / Trypanosoma cruzi |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Processing body (P-body)は真核生物における細胞質mRNP（mRNA-蛋白質複合体）顆粒のひとつで、mRNAの分解や翻訳抑制を担う。P-bodyは定常状態の細胞にも存在しているが、ストレス刺激などの環境の変化でさらに形成が誘導される。そしてそこにはポリソームを離れたmRNAと翻訳不活化を担う蛋白質との複合体がリクルートされてくる。寄生虫感染の初期には、自然免疫応答として宿主のストレス応答関連蛋白質やサイトカインなどの翻訳調節が迅速かつ的確に行われていると考えられるが、その制御機構については不明な点が多い。これまでの研究で、偏性細胞内寄生原虫Trypanosoma cruzi (T. cruzi)のin vitro感染でP-bodyの形成が誘導されることを見出だした。また、P-bodyの必須構成蛋白質をノックダウンし、P-bodyの形成を阻害した細胞へのT. cruzi感染では、感染効率および細胞当たりの原虫(amastigote)数が顕著に増加することがわかった。このことから、感染によって形成誘導されるP-bodyが、T. cruzi の侵入およびamastigoteの増殖を抑制する働きをもつことを明らかにした。この効果は、抗寄生虫応答に関わる宿主遺伝子がP-bodyで翻訳調節を受けることによるものであると考えられる。 そこで現在、感染時に形成されるP-bodyで翻訳調節を受ける宿主mRNAを網羅的に同定し、その機能を解析することを目的とした実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず、T. cruziをヒト繊維肉腫HT1080細胞に感染させ、非感染および感染後24時間のcell lysateから、P-bodyの必須構成蛋白質であり翻訳抑制機能をもつことが知られているLsm14A蛋白質に対する抗体を用いて免疫沈降を行った。ウェスタンブロット法によりLsm14A蛋白質が効率よく沈降されていることを確認した。Lsm14AはSm様蛋白質ファミリーメンバーであり、U6 snRNAと結合することがすでに知られている。そこで、沈降前のcell lysate (input sample)と沈降後 (IPed sample) のサンプルそれぞれから抽出したRNAよりcDNAを作製し、定量PCR 法によりU6 snRNA量を調べた。その結果、input sampleと比較して IPed sampleのU6 RNA量が10倍であったことから、Lsm14Aと結合しているRNAを効率よく沈降できていると考えられた。次に、input sampleから精製したmRNAとIPed sampleから抽出したRNAから、次世代シーケンス解析用のcDNAライブラリを調整し、イルミナ社Nextseq 500を用いてシーケンシング解析を行った。その結果、感染細胞でinput sampleと比較してIPed sampleにより濃縮されてくる325個の遺伝子を同定した。そのうち、非感染細胞と比較して感染細胞で2倍以上IPed sampleに濃縮されてきたのは５個であった。このように、感染時特異的にLsm14Aにリクルートされてくる候補遺伝子の絞り込みができたことから、ここまでの研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次世代シーケンシングで同定された各々の遺伝子について、データの正確性を再びP-body免疫沈降と定量PCR法を用いて評価する。同定した個々のmRNAの機能解析により、それら遺伝子の宿主感染応答における重要性について検討を行う。またこれら遺伝子のP-bodyによる発現制御の経時的変化についても解析する。さらに、これまでの結果からヒトマクロファージTHP-1細胞へのT. cruzi感染でもP-bodyの形成が誘導されることを確認しているので、THP-1細胞についても同様の実験を行い、HT1080細胞での結果と比較する。
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| Causes of Carryover |
次世代シーケンシングの結果を確認するための定量PCRを平成27年度内に行う予定であったが、シーケンシングの結果を得るのに予定以上の期間を要したため未使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度の未使用額は定量PCRに必要な試薬類を購入する経費に充てる。平成28年度の経費の主な用途は消耗品である。その内訳は細胞培養に必要な培地、血清、デイッシュなどのプラスチック製品、ガラス器具、抗体、オリゴ作製費、試薬類である。また国内学会で研究成果を発表するために必要な旅費も使用予定である。
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