2014 Fiscal Year Research-status Report
Vibrio alginolyticusのコラゲナーゼの産生誘導機構の解明
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26860290
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
美間 健彦 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (80596437)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Vibrio alginolyticus / コラゲナーゼ / 発現誘導 / 発現調節 / 二成分制御系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、Vibrio alginolyticus I.029株においてVarS/VarA二成分制御系がコラゲナーゼの産生を制御していることを明らかにした。他の細菌におけるホモログの報告から、VarS/VarA系は、small RNA（sRNA）の発現調節を介して下流の遺伝子発現を制御していると予想された。そこでV. alginolyticus I.029株の染色体DNAのドラフト配列を探索し、sRNAをコードしていると予想される領域を同定した。varS欠失株およびvarA欠失株中でのsRNAの発現量をqRT-PCR法およびnorthern blot法を用いて調べたところ、両欠失株においてsRNAの発現量が親株と比較して大きく低下していた。さらにゲルシフト法によりVarAがsRNAのプロモーター領域に結合することが明らかとなった。以上の結果から、sRNAをコードしていると予想された領域が確かにsRNAとして発現され、その発現がVarS/VarA系によって直接制御されていることが明らかとなった。次にV. alginolyticus I.029株の染色体DNA上のsRNAをコードする領域を欠失させた変異株を構築し、コラゲナーゼの産生を調べた。その結果、sRNA欠失株はvarA欠失株と同様にコラゲナーゼの産生が遅延した。さらにsRNA発現プラスミドを構築しvarS欠失株に導入したところ、varS欠失株が失ったコラゲナーゼの産生が回復した。以上の結果から、VarS/VarA系はsRNAの発現調節を介してコラゲナーゼの発現を制御していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
これまでにVarS/VarA二成分制御系が発現を直接制御しているsRNAを同定した。さらにVarS/VarA系がそのsRNAの発現調節を介してコラゲナーゼの産生を制御していることも明らかにした。
センサー・キナーゼ遺伝子varSの欠失株はコラゲナーゼ産生能を完全に欠損したが、レスポンス・レギュレーター遺伝子varA欠失株ではコラゲナーゼの産生が遅れるのみであった。このことからVarSが、他の二成分制御系のレスポンス・レギュレーターも介して（cross-talk）、コラゲナーゼの発現を制御していると予想された。そこで大腸菌の二成分制御系の網羅的解析の報告を参考にし、VarSとcross-talkすると予想されたレスポンス・レギュレーターをコードする遺伝子をV. alginolyticus I.029株の染色体DNAのドラフト配列上で探索した。その結果、２つのレスポンス・レギュレーター遺伝子（narPとcusR）が同定された。そこでvarA欠失株の染色体DNA上のnarPまたはcusRをそれぞれ欠失させた二重変異株を構築し、それら変異株のコラゲナーゼ産生能を調べた。その結果、varAとnarPの二重欠失株ではコラゲナーゼ産生能を欠損した。一方varAとcusRの二重欠失株のコラゲナーゼ産生は、親株であるvarA欠失株との間に差は見られなかった。以上の結果から、VarSはVarAとともに、NarQ/NarP二成分制御系のレスポンス・レギュレーターNarPともシグナル伝達を行いコラゲナーゼの産生を調節していることが示唆された。
以上の結果からVarS/VarA系によるコラゲナーゼの発現調節がより複雑な経路を介して行われていることが明らかとなり、その全容の解明に向けて本研究が大きく展開している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究の結果、V. alginolyticus I.029株のVarS/VarA二成分制御系がsRNAの発現調節を介してコラゲナーゼの発現を制御していることが明らかとなった。今後は、VarS/VarA系によるsRNAの発現調節がどの様にコラゲナーゼの発現調節に繋がっているのか明らかにする。sRNAは自身にRNA結合タンパク質CsrAを結合することで、CsrAが翻訳をrepressionしているタンパク質のderepressionを起こすことが他の細菌において報告されている。そこで、VarS/VarA系が制御するsRNAも同様の機構で下流のタンパク質の翻訳を制御しているか明らかにする。さらに他の菌においてVarS/VarA系が制御するsRNAが複数存在することが明らかとなっている。そこでV. alginolyticusにおいても、これまでに同定したsRNAとは別のsRNAがコードされているか調べる。
これまでの研究の結果、センサー・キナーゼVarSは、NarQ/NarP系のレスポンス・レギュレーターNarPともシグナル伝達を行うことが予想された。今後は、NarPを精製してin vitroリン酸化実験を行い、実際にVarSとNarPがリン酸基の転移を介したシグナル伝達を行うか明らかにする。さらにリン酸化されることで活性化したNarPがどのようにコラゲナーゼの発現を制御しているかも明らかにする。
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| Causes of Carryover |
物品の購入が予定よりも安かったため、次年度の使用とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究が当初の計画以上に進展しているため、次年度使用額を有効に利用して研究を展開する予定である。
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