HIV-1 インテグラーゼのDNA二重鎖切断部位へのリクルート機構

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860313
• Research Institution: Research Institute, International Medical Center of Japan
• Principal Investigator: 飯島 健太 独立行政法人国立国際医療研究センター, その他部局等, その他 (20565626)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: DNA二重鎖切断 / Vpr / integrase

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではHIV-1 インテグラーゼ（IN）のDNA二重鎖切断（DSB）部位へのリクルート機構とIN活性非依存的なDSB部位へのウィルスDNA挿入機構を明らかにすることを目的としている。
これまでの研究で申請者はMicro-irradiationにより誘導したDSB部位へのINの迅速なリクルートにはHIV-1アクセサリータンパクであるVprのDSB部位へのリクルートが要求されること、およびVprとINが細胞内において相互作用することを明らかにしている。INのDSB部位へのリクルート機構を明らかにするために、まずVprのDSB部位へのリクルートを制御する因子を探索を試みた。候補因子の一段階目のスクリーニングとして、DSBシグナル伝達因子の阻害剤を用いて、Micro-irradiationにより生成したDSB部位へのVprのリクルート動態の解析を行ったところ、VprのDSB部位へのリクルートはATM、DNA-PKcs、およびポリユビキチン化の経路に依存しないことが明らかとなった。このことから、VprのDSB部位へのリクルートはDSBシグナル伝達の最上流、すなわちDSBのセンサータンパク群に依存していることが示唆されたため、これらのタンパクの1つ(タンパクAとする)を欠損した細胞においてVprのDSB部位へのリクルートを解析した。その結果、VprのリクルートはタンパクA欠損細胞においては観察されず、タンパクAの相補細胞においてはVprのリクルートが回復することが確認された。さらに、タンパクAとVprのin vitro、およびin vivoにおける結合性が確認され、タンパクAとのタンパク間の相互作用を介して、Vpr、およびINはDSB部位へと迅速にリクルートされることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成26年度の研究においてINのDSB部位へのリクルートの責任因子の同定のために、①Micro-irradiationによるVprリクルートの責任因子の探索と、②IN結合因子のLC/MSを用いた解析系を計画していた。その過程において当初の計画通りにMicro-irradiationによるDSB部位へのVprのリクルートを指標としてスクリーニングを行い、Vprリクルートの責任因子として、タンパクAを絞り込むことに成功した。さらにタンパクAはin vitro、およびin vivoにおいてもVprと相互作用することが明らかとなり、細胞内においてタンパクA/Vpr/INは３者の複合体を形成し得ることが示唆される。そのため、タンパクAは、②の解析系によるスクリーニングの要件も満たす因子であると判断され、平成26年度の達成目標としていたIN/Vprリクルートの責任因子の同定については達成されたものと考えている。一方でVpr非依存的なINリクルート機構へのタンパクAの関与については未だ解析が進行しておらず、平成27年度の前半において明らかにしてゆく。
平成26年度のもう1つの大きな研究課題として、VprのDSB部位へのリクルートの生物学的な機能についての解析を行った。VprのDSB部位へのリクルートがDSBの修復経路に干渉する可能性を検証するためにDSB修復のレポーター細胞において、Vprの発現下でDSB修復の効率、および性状について解析を行った。その結果、Vpr発現下おいてはDSB修復能が低下し、また修復末端の性状についてもVpr非発現のものと比較して明らかに異なるプロファイルを示すことが明らかとなった。そのため当初の本年度の達成目標を達成し、平成27年度の研究の基盤が得られているものと考えている。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度においてVprのDSB部位へのリクルート責任因子として同定したタンパクAの欠損細胞、および相補細胞（野生型、部分変異型）を用いて、HIV-1感染におけるタンパクAの重要性、およびその作用機序について明らかにする。特にDSB部位へのIN活性非依存的なウィルスDNA挿入については効率、および挿入末端性状について詳細な解析を行い、タンパクAのウィルス学的な意義について明らかにする。さらにVpr欠損型のHIV-1ウィルスにおいても同様の実験を行うことにより、タンパクA、Vpr、およびINの3者の物理的、機能的相互作用がもつウィルス学的な意義について明らかにしてゆく。これらの解析から得られる知見を基盤として、DSB部位へのIN活性非依存的なHIV-1 プロウィルスDNAの挿入抑制法について検討を行う。一方で、INのChIP法による解析の結果、Vpr非依存的な機構によってもINはDSB部位へと集積することを明らかにしており、このようなDSB導入後の後期におけるINリクルートへのタンパクAの関与、あるいはその他その制御因子についても解析を進めてゆく。
またこれまでの解析によって、VprがDSB部位への集積能に依存して宿主細胞のDSB修復経路に対し抑制的な作用を持つことが明らかとなってきた。そのため、Vprのウィルス感染時の機能解明に加えて、VprによるDSB修復経路への干渉という新規の視点からの、Vprによるゲノム不安定性誘導機構の作用機序、およびエイズ関連発がんとの関連についても解析を進めてゆく。
以上の研究データを取りまとめ、平成27年度内での国際学術誌への投稿を目指す。