肝線維化に伴うmicroRNA発現変化を介した肝癌幹細胞維持メカニズムの解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860513
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 三馬 聡 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (30437892)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 肝癌幹細胞 / sphere形成 / microRNA122

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、肝癌幹細胞においてmiR-122発現が低下すること、そしてこのmiR-122発現低下が、肝癌幹細胞stemnessに対し、促進的に働くことを明らかにすることを目的としている。
（検討1）臨床検体により解析予定であるが、適切な表面マーカーを明らかにし解析を行う予定としている。下記検討ののち、解析を行っていく。
（検討2）肝癌幹細胞miR-122発現低下が肝癌幹細胞stemnessに与える影響の解析：当初、肝癌細胞株(Huh7、Hep3B)のCD133(+)EpCAM(+)細胞をFACSにてsortingを行い、肝癌幹細胞として解析を行う予定であった。しかし表面マーカー陽性細胞が培養細胞中の癌幹細胞としてはあまりに多くの割合を占めており、これにより抽出し、解析を行うことは不適切であると考えられた。そこで表面マーカーではなく、sphere形成能によりその肝癌幹細胞集団の抽出を試みた。Ultra low attachment dish、stem cell専用培地を用い、shere形成能を有する細胞を抽出したところ、これにより得られる細胞では、stem cell発現遺伝子NANOGがparental cellsと比較し数十倍と癌幹細胞抽出を同手法に改変している。
（検討3）肝線維化微小環境においてmiR-122発現低下が肝癌幹細胞stemnessに与える影響の解析：現在、培養活性化肝星細胞（HHSteC、LX-2cell）との共培養を行い、mir-122発現量により、肝癌幹細胞が受ける遺伝子変化の解析を進めている。また報告では老化した肝星細胞の肝発癌に対する重要性も報告されており（Yoshimoto et al, Nature 2013）、Etoposide処理により細胞老化を誘導した肝星細胞も用い解析を行う準備を進めている。すでにこれら老化した肝星細胞も肝星細胞では分泌される細胞外小胞（エクソソーム）も抽出し、その質的変化を明らかにした。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

細胞表面マーカーによって肝癌幹細胞を抽出する予定であったが、これによる抽出では肝癌幹細胞集団の純度が低くなってしまったことが③の大きな理由となっている。しかしsphere形成能を用いることにより、肝癌幹細胞の純度を高めることには成功しており、今後mir-122発現が肝癌幹細胞のstemnessに与える影響について解析を進めていくことができるのではないかと考えている。

Strategy for Future Research Activity

現在、sphere形成能による肝癌幹細胞抽出を行っている。しかしsphere形成能のみでは、real-time PCR、western blottingによる解析でも肝癌幹細胞の濃縮は不十分であると考えており、加えて低酸素培養環境、及び抗癌剤耐性能もあわせ、癌幹細胞の濃縮を行っている。
また、JARID1B（KDM5B，PLU-1）の癌幹細胞における発現、及びstemnessに影響を与えることが報告され、これについても当科では注目している。miR-122発現がこれに与える影響についても合わせて解析を行い、本研究を推進していきたいと考えている。