2015 Fiscal Year Research-status Report
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26860578
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80415588)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 心筋細胞 / Long Non-coding RNA / iPS細胞 / 心筋分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度はhuman iPS細胞（hiPSC）の心筋分化誘導時に有意差をもって発現するlong non-coding RNA（lncRNA）を特定した。そこで本年度は特定したlncRNAと心筋分化誘導との関わりをgain of function（強制発現系）とloss of function（発現抑制系）にてそれぞれ評価した。強制発現系はレンチウィルスベクターpLenti-EF1a-GFP-2A-Puro Vector（Applied Biological Materials Inc.）にlncRNAの全長を挿入し、hiPSCに導入した。導入したhiPSCはPuromycinにてセレクションし、強制発現系を構築した。このhiPSCを心筋細胞に分化誘導したところ、有意差を持って心筋分化誘導関連遺伝子（GATA4, MEF2C, TBX5, BAF60C, TBX20, HAND2, cTNT）の発現量が1.5から4倍増加した。一方で発現抑制の系をsmall interfering RNA (siRNA)やLocked Nucleic Acid (LNA)にて数回試してみたものの、安定した遺伝子発現抑制の系の構築に苦難している。
またRNA-sequenceの解析結果を詳細に検討しなおし、本系が効率的な心筋分化誘導系であることも改めて解析することができた。心筋分化誘導5日目にCardiac Mesoderm遺伝子（MESP1, MESP2, KDR, KIT, CXCR4, PDFGRa）が一過性に発現し、心筋分化誘導7日目にCardiac Progenitor遺伝子（NKX2-5, GATA4, MEF2C, HAND1, HAND2, MYOCD, TBX5, TBX20, ISL1）の発現も増加していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前述のとおり、遺伝子発現抑制系の構築に苦難している。そこでTet-On
3GシステムのshRNA lenti virus vectorにて特定の時期のみに遺伝子発現抑制を可能とするシステムを新たに構築する予定である。これ以外は概ね順調に進展しており、様々な評価系を構築しつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度はshRNA Lenti virus vectorを用いた遺伝子発現抑制系を構築する。さらに本lncRNAと結合するタンパク質の特定をImmunoprecipitation（IP）の系を応用したBiotin RNA-IPの系にて特定する。IP後、SDS-PAGEにて泳動し、MS解析にて、本lncRNAと結合するタンパク質を特定していく。特定したタンパク質は免疫染色等で評価し、その局在と機能について解析していく。また、これらの結果は積極的に国内外の学会にて発表をしていく。
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