心筋分化誘導に関連するlncRNAの探索と解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860578
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80415588)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 心筋細胞 / Long non-coding RNA / iPS細胞 / 心筋分化誘導

Outline of Annual Research Achievements

昨年度は特定した心筋分化誘導時に特異的に発現するLong non-coding RNA (lncRNA)に結合するタンパク質の解析を中心におこなった。最初に決定した全長配列を参考に鋳型をPCRにて作製し、5’の直上にT7プロモーターを付与した。この鋳型をPCRにて大量に増幅させた後、T7RNAポリメラーゼとBiotinラベルしたウリジンとその他核酸を添加し、目的Biotin-lncRNAも大量に合成できた。合成したBiotin-lncRNAのアガロースゲル電気泳動をしたところ、単一のバンドで目的サイズ付近に存在していたことから、Biotin-lncRNA合成は成功したと考えられる。
このBiotin-lncRNAにiPS細胞から心筋細胞へ分化誘導過程のタンパク質と混合することで、このBiotin-lncRNAと結合するタンパク質を決定することにした。誘導はlncRNAの発現がピークに達する誘導日を用いた。この際、ネガティブコントロールとして、目的配列と逆配列のBiotin-lncRNAも合成し、これを利用した。
これらのタンパク質はBiotin-RNAと反応させたのち、Streptavidin magnetic beadsにて濃縮した。濃縮したタンパク質溶液はSDS-PAGEによって分離し、複数の大きさによってゲルを回収し、これらのゲルをそれぞれLC-MS/MS解析にて解析し、心筋分化誘導時にこのlncRNAと特異的に結合する候補タンパク質を絞り込んだ。
発現抑制モデルの作製には苦慮しており、引き続きlentivirus系にて行っていく。本系の確立はlncRNAの重要性の評価にも繋がるため、樹立していきたい。またこれらの系と誘導系における遺伝発現変化を評価することで本lncRNAと関連した下流シグナルの解析も可能になる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

心筋分化誘導時に特異的に発現するlncRNAの特定とそれに結合するタンパク質の特定は予定通り進んでいる。これらのタンパク質の心筋分化誘導時における機能解析を今年度に行い、各研究会等にて報告していく予定である。
一方でiPS細胞への恒常的な遺伝子抑制モデル作製には苦慮しており、導入効率が以前低いままである。現在はこちらの系は一旦停止し、機能タンパク質解析に重点を置いている。

Strategy for Future Research Activity

今後はLC－MS／MS解析にて特定した候補タンパク質を評価する系としてウェスタンブロッティングの抗体の最適化を試みている。また候補タンパク質の特性と細胞局在等の既報情報を集めつつ、核内でのlncRNAとの関連も評価していく。その後、このタンパク質抗体を用いてIPを行い、lncRNAが含まれているかもチェックする。さらにそれぞれのタンパク質をCRISPR/Cas9システムにて破砕したiPS細胞ラインを樹立し、それぞれを心筋分化誘導を試みることでこれらのタンパク質の重要性について評価する。またIPしたサンプルをホルマリンで固定した後にRNase処理し、RNA抽出をすることでそれぞれのタンパク質との結合部位を評価するなどの基礎データを解析していく。