2015 Fiscal Year Research-status Report
気道リモデリング形成に伴うSiglecを介した好酸球炎症制御経路障害の解明
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26860596
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
際本 拓未 筑波大学, 医学医療系, 講師 (80724773)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Siglec-F / Muc5b / Muc4 / 気道リモデリング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス好酸球特異的に発現するSiglec-Fは、好酸球をアポトーシスに誘導することで炎症制御に関与する(Kiwamoto T, et al. Pharm acol Ther. 2012 & Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2013)。これはヒト好酸球特異的に発現するSiglec-8に相当し、申請者は気道上皮及び気管粘膜下腺に発現している粘液ムチン(Muc4及びMuc5b)がSiglec-Fリガンド能を有していることを見出した(Kiwamoto T, e t al., J Allergy Clin Immunol. 2015)。上記結果はこれまで未知であったSiglecを介した好酸球性気道炎症制御を示す重要な成果であり、実際の疾患モデルでの検証が待たれる。
本年度はマウスSiglec-Fのリガンドとなる気道粘液ムチンを定量化・分画を抽出するための試適条件を検討行うべく予備実験を施行した。また高分子量ヒアルロン酸がSiglecのリガンド能を有することが最近報告されたことより、好酸球性気道炎症病態下におけるヒアルロン酸の合成能の変化についても検証も行った。気道ムチンの解析については現在至適条件の検証を行っているが、肺のヒアルロン酸合成能に関しては、ヒアルロン酸合成酵素HAS2の上昇を認めた。以上より、慢性好酸球性気道炎症病態において気道粘液ムチン・ヒアルロン酸双方がSiglecを介した炎症制御に関与している可能性が示唆された。成果については過去の研究成果と併せ、日本アレルギー学会、EAAS等で報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成27年度以降の実施計画は前年度に構築・検証されたC57BL6系マウスにおける卵白アルブミン(OVA)反復刺激による気道リモデリング病態モデルを用いた、慢性好酸球性気道炎症病態におけるSiglecの関与の解明であった。
過去にリガンドとして同定された気道ムチンの解析については現在至適条件の検証を行っているが現時点では、Muc4及びMuc5bそれぞれのもつリガンド活性変化の検証については基礎データが蓄積されつつあるものの、不十分であり今後さらなる検討を要すると思われる。一方で、最近の報告において肺の線維化に関連する、高分子量ヒアルロン酸がSiglecのリガンド能を有することが判明したこと(Secundino I, e t al., J Mol Med. 2016)、当研究室においても過去に喘息患者及び健常者におけるゲノムワイド関連解析により、日本人においてヒアルロン酸合成酵素HAS2の遺伝子多型が喘息感受性を持つ可能性があることを見出していたことより(Yatagai Y, et al., Clin Exp Allergy. 2014)、好酸球性気道炎症病態下におけるヒアルロン酸の合成能の変化についても検証も行ったところ、HAS2の発現の亢進が、好酸球性気道炎症群で認められ、気道粘液ムチン・ヒアルロン酸双方がSiglecを介した炎症制御に関与している可能性が示唆された。
上記の通り、Siglecの機能障害に伴う気管支喘息難治化のメカニズムの解明に際し、ヒアルロン酸機能異常の関与の可能性を当初の計画以上の成果として見出すことに成功した一方で、気道粘液ムチンの機能異常に関しては解析が不十分であること、当初使用予定であったSiglec-F欠損マウスが繁殖元のトラブルにより搬入に遅延が生じていること、本学が震災に被災したことに伴う耐震補強工事の遅延により年度内に複数回の研究室移転を余儀なくされたことによる遅れを踏まえ現時点での進捗度は、(3) やや遅れているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、気道リモデリング形成に伴うMuc4及びMuc5bの発現・糖修飾障害の解明を継続しつつ、同様にSiglecリガンド活性を持つヒアルロン酸動態の変化についても解析を行う。
具体的には、①気道リモデリング形成時には杯細胞過剰に形成され、基底膜下の線維化も進行していることから、ムチン及びヒアルロン酸分画に変化が生じているものと予想される。 本研究では気道リモデリング系構築後、昨年からの課題である分泌型ムチンであるMuc5bと細胞表面発現型ムチンであるMuc4の発現量、そしてヒアルロン酸分画の変化を、急性炎症群及び慢性炎症群それぞれで比較することを目指す。 有意な差が期待できる場合はELISA法にてMuc4及びMuc5bを定量評価する。タンパク発現量での比較が困難な場合は、Real Time PCR(現有設備)での比較を検討する。②気道リモデリングに伴う上皮の構造変化はMuc4/Muc5b 及びヒアルロン酸のSiglecリガンド活性を付与する糖鎖修飾プロセスに異常をきたしていることが予想される。本解析においては、申請者らが確立したSiglec-F/ヒトIgG-Fc領域キメラ蛋白(Siglec-F-Fc)を用いたWestern blotting法でリガンド活性を持つ分子を検出する方法を応用し(Kiwamoto T, et al., J Allergy Clin Immun ol. 2014)、肺Muc4・Muc5b及びヒアルロン酸を免疫沈降法にて抽出、Siglec-F-Fcで標識することで各病態におけるムチンリガンド活性の変化を定性的に比較する。また、上記検討で有意差が期待できる場合は現在導入手続き中のSiglec-F欠損マウスを用いてSiglec-F経路の障害が糖鎖リガンドに及ぼす影響を検証する。また、ヒアルロン酸機能異常とSiglecに関連があることがより示唆される場合には、ヒアルロン酸合成酵素欠損マウスを使用し検証を行うことを考慮する。
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[Journal Article] Reply: To PMID 25497369.2015
Author(s)
Bruce S. Bochner, Takumi Kiwamoto, Toshihiko Katoh, Zhou Zhu, Michael Tiemeyer
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Journal Title
Journal of Allergy and Clinical Immunology
Volume: 135
Pages: 1662-3
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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