赤血球の概日リズムの同調機構の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26860615
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 大澤 要介 慶應義塾大学, 医学部, 特任助教 (50528429)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ペルオキシレドキシン / 概日リズム / 赤血球 / BRET / 睡眠時無呼吸症候群 / 間欠的低酸素 / 低酸素培養 / K562

Outline of Annual Research Achievements

ヒト赤血球におけるペルオキシレドキン２ (Prx2)の二量体形成と単量体への解離の概日リズムを測定する条件を決定するため、貴重なヒト検体を使用する前に、ヒト赤白血病細胞株K562を疑似赤血球として予備検討を行った。K562細胞にPrx2を含む生物発光ドナーと蛍光アクセプターをコードするBRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer: 生物発光共鳴エネルギー移動)コンストラクトをエレクトロポレーションにて遺伝子共導入し、酪酸ナトリウムにより、ヘモグロビンを産生する赤芽球系細胞へ分化させた。この細胞に過酸化水素を30分間添加し、Prx2の二量体形成を促進させると、約24時間後に再び二量体形成に由来するBRETシグナルを観測できた。

本研究ではこれまで、生物発光ドナーと蛍光アクセプターをそれぞれコードする2種類のプラスミドを遺伝子共導入していたため、BRETシグナルを放出するために必須の両方のプローブを発現する細胞は、あまり多くなかった。そこで、遺伝子導入された細胞でBRETシグナルを確実に得るため、同一のプラスミド上に生物発光ドナーと蛍光アクセプターをコードする遺伝子とその遺伝子の間にIRES（Internal Ribosomal Entry Site: リボソーム内部進入部位）を配置したバイシストロニックBRETコンストラクトを作製した。この改良によってBRETシグナルの強度と特異性が飛躍的に向上すると考える。

以上の研究から、ヒト赤血球におけるPrx2二量体形成の概日リズムを測定するためのモデル細胞を確立することができた。このモデル細胞を用いて、睡眠時無呼吸症候群の患者における間欠的低酸素を模した低酸素培養がPrx2の概日リズムの位相に与える影響を精査することで、赤血球の概日リズムの同調機構を明らかにする予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本年度はヒト赤血球にタンパク質導入するタンパク質プローブを精製し、導入条件を検討する予定であった。しかし、Prx2の概日リズムの測定に際して、疑似赤血球として用いたK562細胞のような浮遊細胞は接着細胞に比べて、表面積が大きいためか生物発光の減衰が大変早かった。そのため、測定系のBRETシグナルの強度と特異性をさらに向上させる必要が生じ、BRETコンストラクトの改良を優先した。

低酸素培養を行うため、炭酸ガスインキュベーターと光電子増倍管を搭載したルミノメーターKronos Dio (ATTO)に酸素センサーを増設したが、本体のどこからか気体が漏れるトラブルがあり、任意の酸素濃度での測定が行えなかった。

Strategy for Future Research Activity

Kronos Dioの気体のリーク箇所を特定・修理し、任意の酸素濃度によるPrx2の概日リズム測定を行う。

Causes of Carryover

次年度使用額の発生は効率的な研究計画の執行に努めたためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

最終年度に使用する消耗品の購入に充てる予定である。