2014 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
26860771
|
|---|
| Research Institution | Saitama Medical University |
|---|
Principal Investigator |
高木 徹 埼玉医科大学, 医学部, 助手 (20536891)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | CTL |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、２つの目的（I. C型肝炎治療ワクチンを完成型に近づける、II. B型肝炎治療ワクチンプロトタイプの作製）のうち、I.を中心に取り組んだ。II.は実験に使用するマウスの作製であるが、HLA-A2.1トランスジェニックマウスと交配予定のHBVトランスジェニックマウスの分与について、米国Scripps研究所Dr. F.V. ChisariからMTA契約書を交わす手続きを進めている。
C型肝炎治療ワクチン研究は大きく2つの内容について取り組んだ。
１）すでにC型肝炎ウイルス（HCV）NS3領域内に治療ワクチン成分として有効なエピトープを同定し、そのペプチドをリポソーム表面に結合したワクチンによる治療成績が、組換えアデノウイルス感染マウスを用いて得られていた。当初効果判定に用いた方法、すなわち感染肝臓中のNS3タンパクをIP/WesternによりNS3バンドの検出する方法は定量性に欠けていた。そこで今回NS3タンパクを高感度に検出するELISA法を作製した。マウスをNS3タンパクで免疫し、9種の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を作製した。これらの抗体でのサンドイッチ法により、5 ng/ml以下の検出感度を持つELISAを樹立した。この方法により治療実験を行ったマウスの肝臓中のNS3を測定している。
２）抗原としてペプチドではなくタンパクを用いたワクチンの作製：ペプチドは特定のHLAタイプを持つ患者にしか有効ではないので、臨床使用には種々のエピトープを同時に含むワクチンが必要となる。リポソーム表面にタンパクを結合すると、それがcross-presentationというメカニズムでMHCクラスI分子に提示され、キラーT細胞を誘導できることが卵白アルブミンを用いた実験で示されていたが、今回NS3タンパクを3つの断片に分けて大腸菌に発現させ、精製し、リポソームに結合させた。その結果、1つのタンパク（NS3-2）を結合したワクチンで強い免疫反応とウイルス感染防御効果が認められた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）NS3検出系は完成したので100%と言える。また作製したモノクローナル抗体は２）のNS3タンパクの精製にも役立った。
２）NS3タンパクは非常に可溶性に乏しく精製が困難であったが、３つの断片（NS3-1~3）に分けさらに親水性のタグを付けて大腸菌に発現させることにより溶解性を向上させた。発現タンパクにはStreptavidin binding epitope tagも付加されていたが、avidinを用いたアフィニティー精製は効率が非常に低く、１）で作製したモノクローナル抗体を用いて精製することに成功した。NS3-2タンパクを結合したワクチンは、c57BL/6マウスに対して優れた強い免疫反応とウイルス感染防御効果を誘導したが、NS3-1とNS3-3タンパクについてもワクチン作成を進めている。達成度50%
|
| Strategy for Future Research Activity |
１）今年度はNS3-2タンパク結合リポソームをC57BL/bマウス（H-2b）に免疫し、反応をELISPOT assay（IFN-g）、flow cytometry（CD8, IFN-g, CD107a）、そしてNS3発現組換えワクシニアウイルスによるチャレンジ実験等で解析したが、他のMHCハプロタイプを持つマウス、BALB/c（H-2d）、HLA-A2.1トランスジェニック、HLA-A24トランスジェニックマウス等でも同様に反応解析を行う。また残りのNS3-1、NS3-3タンパクについても同様の解析を行う。
２）細胞傷害性なしに主にサイトカイン（IFN-g）産生による抗ウイルス活性を誘導するリポソームワクチンの開発を進める。すでにA2-11、A2-12ペプチドについてそのような活性が認められており、そのウイルス増殖抑制機構の解析を進めるとともに、同様なエピトープをHCV全領域について探索・同定を行う。
３）HCV全領域での抗原エピトープ同定のために、ウイルスタンパクのアミノ酸配列からHLA-A2.1結合モチーフを持つエピトープ候補をコンピュータ解析で選び、ペプチドを合成し（ユーロフィンジェノミクスO-PLUS）リポソームに結合して選定する。
４）B型肝炎ウイルスワクチン開発のため、３）と同様にHBVのエピトープを同定する。
|
| Causes of Carryover |
HCVおよびHBV全領域での抗原エピトープ同定はH27年度以降実施する予定にしており、それに必要なペプチド合成（ユーロフィンジェノミクスO-PLUS：約60万円）も交付額の関係で次年度に繰越を行い購入することとした。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度はペプチド合成（ユーロフィンジェノミクスO-PLUS：約60万円）の購入が主な使用目的である。その他として、ELISPOT assay kit、flow cytometryに使用するラベル抗体、CTL活性を調べるために51Cr、細胞培養試薬の購入も行う予定である。
|
