2015 Fiscal Year Research-status Report

WASP異常症及び新規常染色体劣勢WASの分子病態と迅速診断法に関する研究

Research Project

Project/Area Number	26860780
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	渡辺祐子東北大学, 大学病院, 助教 (40610671)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	WASP / WASP恒常的活性化変異 / WIP欠損症 / X染色体連鎖性好中球減少症
Outline of Annual Research Achievements	恒常的活性化WASP変異による好中球減少症とMDS発症の分子機構について、論文化し発表できた（CY Looi,et al.Int.Immunol.26(6):341-352.2014)。 X染色体連鎖性好中球減少症は、WASP恒常的活性化変異（L270P)により起こるHAtag付加したL270P恒常的活性化変異型WASP遺伝子発現ベクターを骨髄球形細胞株K562に恒常的発現させ、最適な恒常的発現細胞株クローン選択した。活性化変異WASP蛋白が細胞の核内に強発現する点、WASPチロシンリン酸化と活性化する点を確認した。この遺伝子導入細胞株より抽出したRNAの、骨髄球形細胞の分化とアポトーシスに関与する遺伝子群の転写についてｃDNAマイクロアレイ解析すると、Protein tyrosine phosphatase受容体c/CD45の高発現と、G-CSF受容体とRunx1の低発現を確認した。すなわち、骨髄球形細胞分化と生存に重要な遺伝子群の発現変化を発見できた。次に、定量RT-PCR法とWestern Blot法で検証し、L270Pにおいて、これら遺伝子群が真に転写活性調節を制御しているかを調べた。クロマチン免疫沈降法では、WASPは転写系に重要であるRNA polymeraseⅡを制御するp54nrbと会合していた。また、免疫蛍光抗体法で細胞核内での複合体形成を確認した。Genomic DNAのクロマチン免疫沈降法と高密度タイリングアレイの組合わせでは、野生型WASPとL270Pでは、同遺伝子座におけるDNA結合パターンは同様だったが、結合親和性は異なっていた。以上より、恒常的活性化WASP変異は、核内に位置し、骨髄球系細胞の転写遺伝子を制御しているといえた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason （１）WASPの細胞核内での新機能解析、WASP恒常的活性化変異によるX染色体連鎖性好中球減少症（XLN)および骨髄異形成症候群（MDS）の分子病態解析は、上記の通り論文発表に至った。（２）一方、常染色体劣性WAS(WIP欠損症）の迅速スクリーニング法の開発、および分子病態解析については、平成28年度の課題として持ち越されている。
Strategy for Future Research Activity	平成27年度の成果をもとに常染色体WASであるWIP欠損症患者と、X染色体連鎖性WASとの病態相違の検討を進めたいと考えている。（１）常染色体劣性WAS（WIP欠損症）の迅速スクリーニング法の開発 WIPはヒトでは常染色体上にコードされている。世界的には1例の常染色体劣性WIP欠損症が報告されているが、本邦ではいまだ診断されていない。本研究では、抗WIPモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリ―法による迅速スクリーニング法を開発し、遺伝子診断系の確立とともに、迅速な確定診断法の確立を目指す。（２）常染色体劣性WASの分子病態の解析 WASの新規病型である常染色体劣性WAS（WIP欠損症：Type-2 WAS)が発見された際には、WASP蛋白発現量を確認し、X染色体連鎖性WASとの病態相違を明らかにし、その疾病の概念を確立する。これは、新病型の分子病態の理解や、WASの遺伝子治療におけるベクター由来のWASP蛋白発現量の調節機構の理解に重要な意義をもつことになる。しかし、現段階ではWIP欠損症患者が見つかっていない。今回、研究期間の延長を承諾頂けたことで、継続して国内外より患者を募り、その臨床像と免疫学的特徴を解析したい。
Causes of Carryover	平成27年度の成果をもとに常染色体WASであるWIP欠損症患者と、X染色体連鎖性WASとの病態相違の検討を進めたいと考えている。しかし、現段階ではWIP欠損症患者が見つかっていない。今回、研究期間の延長を承諾頂けたことで、継続して国内外より患者を募り、その臨床像と免疫学的特徴を解析したい。
Expenditure Plan for Carryover Budget	（１）常染色体劣性WAS（WIP欠損症）の迅速スクリーニング法の開発 WIPはヒトでは常染色体上にコードされている。世界的には1例の常染色体劣性WIP欠損症が報告されているが、本邦ではいまだ診断されていない。本研究では、抗WIPモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリ―法による迅速スクリーニング法を開発し、遺伝子診断系の確立とともに、迅速な確定診断法の確立を目指す。（２）常染色体劣性WASの分子病態の解析 WASの新規病型である常染色体劣性WAS（WIP欠損症：Type-2 WAS)が発見された際には、WASP蛋白発現量を確認し、X染色体連鎖性WASとの病態相違を明らかにし、その疾病の概念を確立する。これは、新病型の分子病態の理解や、WASの遺伝子治療におけるベクター由来のWASP蛋白発現量の調節機構の理解に重要な意義をもつことになる。
Remarks	補助事業期間延長承認　平成28年3月22日