2016 Fiscal Year Research-status Report
超微形態と独創的実験系によるＲｅｔｔ症候群の「非」神経器官の解析による全病態解明
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26860813
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
入江 理恵 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (90381178)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 脳・神経 / 脳神経疾患 / 細胞・組織 / 生理活性物質 / 解剖学 / 超微形態学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Rett症候群(RTT)の原因遺伝子であるMeCP2遺伝子のノックアウトマウスでは、神経系以外の組織で光学顕微鏡レベルでの形態異常を見出した(未発表)。我々は、現在この形態異常がMeCP2遺伝子に因るものであることを証明するための研究を行っている。まずこの某器官の組織標本を作製し、種々の抗体を用いて免疫染色を実施した。さらに、マウスにおけるこの器官を誘導する因子を産生する細胞の形態を観察したところ、光学顕微鏡レベルではなく、電子顕微鏡レベルでの形態異常を見出した。次に、この細胞の存在する臓器に含まれる当該物質をELISAを用いて測定したところ、野生型と比較すると顕著に濃度が低下していた。さらにその物質の受容体を元々形態異常が観察された器官での発現を免疫染色で確認したところ、受容体の発現も低下していることを明らかにした。
次年は、上記の現象がin vitroで再現できるかを、表現型に異常が見られた培養細胞種で確認した。RNi法により、MeCP2遺伝子をノックダウンさせて、RTTモデルマウスと類似したMeCP2発現状態を再現した(MeCP2発現は、野生型と比較して80%以上低下した)。このMeCP2ノックダウン細胞をセルソーターで分取し、得られた細胞をライン化することに成功した。得られた細胞については、MeCP2発現のみならず、生理活性物質産生濃度の低下や、生理活性物質産生のパスウェイに関する種々の律速酵素群を定量PCRにて一つ一つしらみつぶしに解析比較している。
神経系以外の組織での組織形成異常と、この原因と予想される生理活性物質産生能の低下が関係していると推察されるが、RTTの神経系以外の器官での形態異常は未だ報告がほとんどないことから、独創性も研究価値も高いと確信している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験系を確立することに成功し、あとはMeCP2と何の遺伝子がダイレクトに関係しているかを確定する段階に至った。現在、生理活性物質産生のパスウェイに関する種々の律速酵素群を定量PCRにて一つ一つしらみつぶしに解析比較している段階であるが、十数種類ある律速酵素についてプライマー作製からPCRの実施に予想以上に時間がかかっている。
神経系以外の組織での組織形成異常と、この原因と予想される生理活性物質産生能の低下が関係していると推察される。RTTの神経系以外の器官での形態異常は未だ報告がほとんどないことから、独創性も研究価値も高いと確信しているが、上記理由のため海外論文投稿まで至っておらず、研究の進行が遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度の計画は、研究の成果を国内外へ発信することである。そのためには、MeCP2遺伝子をRTTモデルマウスに再導入し、機能回復するか否かを確認する予定である。本年度中に国際雑誌への論文投稿、国内学会での成果発表を目指す。
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| Causes of Carryover |
MeCP2遺伝子の当該細胞への直接的関与を実証するための、MeCP2遺伝子の再導入による生理活性物質産生の機能復活を確認するという、MeCP2遺伝子とこの生理活性物質の関係を決定づける検証実験を行うための、継続した細胞培養と遺伝子導入を実施しなければならないため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在分取してライン化した細胞を使用するため、新規の細胞購入は不必要だが、培地や血清、ピペットやシャーレなどの購入が必要である。遺伝子発現確認のためのPCR試薬やウエスタンブロットに用いる抗体、生理活性物質定量に係る経費にも充てる。
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