2015 Fiscal Year Research-status Report
iPS細胞を用いた神経堤症モデルの作製及び神経堤症に対する創薬を目指した病態解明
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26860823
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
奥野 博庸 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (70445310)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 神経堤細胞 / 遊走 / CHARGE症候群 / 方向性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
目的：神経堤細胞は第４の胚葉と呼ばれ、多くの器官形成に重要な役割を果たしている。iPS細胞を用いたヒト神経堤症に関する研究を通して、神経堤細胞の異常のために視覚、聴覚、嗅覚などに障害を持つCHARGE症候群の治療に役立てたいと考える。２年目である平成27年度は、①神経堤細胞の遊走の方向性に関して、in vitroモデル作成に成功した。②ニワトリ胚へ導した神経堤細胞を移植し、iPS細胞由来神経堤細胞がin vivoで背側から腹側へと遊走する系を確立した。
成果：我々はすでにCHARGE症候群由来iPS細胞作成、堤細胞の作成、およびxCelligenceを用いた遊走能解析によりCHARGE症候群神経堤細胞の遊走障害をみる系を確立している。平成27年度は、1)神経堤細胞の遊走方向性の解析：iPS細胞由来神経堤細胞を8wellチェンバーに播種し創傷治癒アッセイを実施した。播種2時間後に細胞固定し、核とゴルジ体の位置より遊走方向性をみた。ゴルジ体の位置が核よりみて創傷部位の120度内にあるときを方向付けられた細胞とカウントし、コントロール由来およびCHARGE由来神経堤細胞を比較したところCHARGE症候群で有意に方向付けられている細胞が少ないことがわかった。（２）タイムラプスを用いた神経堤細胞の遊走解析：健常人iPS細胞由来神経堤細胞および患者iPS細胞由来神経堤細胞を別々の蛍光標識をし、混ぜ合わせたものを8well チェンバーに5*10^3/wellで播種し、自律的な動きをタイムラプスで解析した。両群を比較し、患者群で有意に移動距離の低下がみられた。３）ニワトリ胚を用いたin vivoでの遊走解析：健常人iPS細胞由来神経堤細胞をHHステージ8-12のニワトリ胚の後脳付近に移植し、iPS細胞由来神経堤細胞がin vivoで背側から腹側へと遊走する系を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
iPS細胞より安定した量および高効率（90%以上）でP75(+)HNK1(+)となる神経堤細胞を誘導することができており、また患者の表現型を複数の解析系でみることができている。
1) 試験管内における遊走能解析(達成度100%)：昨年までにみつけたxCelligenceを用いた遊走能解析に加えて、創傷治癒アッセイや個々の細胞の移動能をみる新たな系を作成し、CHARGE症候群で健常人とは異なる表現型を複数認めた。
2) in vivoでのiPS細胞由来神経堤細胞の遊走（達成度100%)：iPS細胞由来神経堤細胞のニワトリ胚への移植時期および移植部位について、条件を各種検討し、背側より腹側へと遊走する時期を見つけた。この系を用いることで、in vivoでのCHAGE由来神経堤細胞および健常人由来神経堤細胞の遊走を比較することが可能となる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究でCHARGE症候群由来神経堤細胞において、試験管内での遊走障害モデルを複数で見出した。また遺伝子発現解析でも遊走に関する遺伝子において健常人由来神経堤細胞とCHARGE症候群由来神経堤細胞において差異を認めた。
＜in vivoにおけるCHARGE症候群および健常人由来神経堤細胞の遊走能の比較＞ニワトリ胚を用いてiPS細胞由来神経堤細胞の遊走をみる系を確立した。２群の遊走を比較するには、同等の条件（移植するニワトリ胚のステージ、移植部位）を統一することが重要である。両群を別々の色で蛍光標識をし、混合したものを同一個体に移植し、遊走能を比較する予定である。
＜遺伝子発現解析＞両群で有意に発現レベルが異なる遺伝子について、ノックダウンや過剰発現を行い、表現型に関与する直接的な因子およびメカニズムを探索する。
＜ChIP-seq解析＞CHRGE症候群の原因遺伝子であるCHD7はクロマチンリモデリング因子として働くことが知られている。CHD7を用いてChIP-seqをすることにより、直接的に結合している領域やターゲット遺伝子を探索する。
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| Causes of Carryover |
誘導した神経堤細胞を用いたChIP-seq解析を計画しているが、平成２７年度は条件検討を行い、実際に次世代シーケンサーにかけるための試薬購入を来年度に持ち越したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２８年度に次世代シーケンサーを用いて検体解析をすることに用いる予定。１検体の試薬購入に30万円くらい必要と計算している。
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Research Products
(2 results)
