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2015 Fiscal Year Research-status Report

脊髄性筋萎縮症患者由来細胞を用いたSMN発現制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number 26860829
Research InstitutionTokyo Women's Medical University

Principal Investigator

荒川 玲子  東京女子医科大学, 医学部, 助教 (40623111)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords脊髄性筋萎縮症 / SMNタンパク質 / イメージングフローサイトメトリー
Outline of Annual Research Achievements

脊髄性筋萎縮症(SMA)はsurvival motor neuron 1(SMN1)遺伝子の欠失、変異により脊髄前角細胞の変性をきたし、全身性の筋力低下を生じる。SMA患者では、SMN2遺伝子由来のSMNタンパク質が生命維持に重要な役割を果たしている。SMNタンパク質はユビキタスに発現しており、本研究においては侵襲が少なく採取可能な患者細胞におけるSMNタンパク質解析法を確立することが重要である。平成26年度に線維芽細胞を用いて確立したイメージングフローサイトメトリー法(IFC)によるSMNタンパク質解析法を発展させ、平成27年度は血液由来のリンパ芽球細胞におけるSMNタンパク質解析法の開発を行った。SMN1遺伝子変異の判明しているSMA患者および健常コントロール、もしくは代諾者へのインフォームドコンセントに文書による同意の上、血液細胞を採取し、引き続きEBウイルスを用いて不死化培養細胞株の樹立を行った。培養後に細胞を固定し、細胞膜透過処理を行い抗SMN抗体(Milli-MarkTM Anti-SMN-FITC clone 2B1 Millipore)およびHoechstによる染色後に、IFCを用いて解析を行った。本手法によりリンパ芽球におけるSMNタンパク質発現の定量および、細胞内局在の定量化をすることに成功した。
また機能を有する全長型のSMNタンパク質を特異的に認識するためにSMNタンパク質のC末領域の必要最小限のペプチド鎖を作成し、特異的なマウスおよびラットモノクローナル抗体の作成を試みたが、非特異的な抗体だけが生産された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

脊髄性筋萎縮症患者由来を用いたSMN発現制御機構の解明にあたっては、侵襲が少なく採取可能な血液細胞での解析法を確立することが重要である。本年度は血液細胞由来のリンパ芽球を用いてSMNタンパク質発現解析を開発することに成功し、本知見をSMNタンパク質複合体形成能(SMN/Gemins形成能)の解析手法に応用し、SMN発現制御機構の検討を進めていく。

Strategy for Future Research Activity

今後は本手法を発展させ、全血細胞を不死化せずに表面抗原マーカーにより血球成分を分画した上で、SMNタンパク質発現解析を行う手法の開発を行う。さらにSMNとgemin3との共染色を行い、機能を有する全長型のSMN蛋白質を特異的に認識する解析手法の開発を進めていく。

Causes of Carryover

SMA患者では、SMN2遺伝子から機能を持たない短縮型SMNタンパク質が作られているため、機能を有する全長型のSMNタンパク質を特異的に認識するマウスおよびラットモノクローナル抗体の作製を試みたが、非特異的な抗体のみが産生された。当初の予定ではモノクローナル抗体精製、大量培養を行う予定であったが、計画を変更せざるを得なくなったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

SMNタンパク質のC末端に結合するGemin3との共結合の解析を行うことにより、機能を有する全長型のSMNタンパク質を特異的に検出する実験系の開発に使用する計画としている。

  • Research Products

    (3 results)

All 2015

All Presentation (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results) (of which Overseas: 1 results)

  • [Presentation] イメージングフローサイトメトリー法を用いた新規SMNタンパク質解析法2015

    • Author(s)
      荒川玲子、大月典子、金子芳、青木亮子、荒川正行、斎藤加代子
    • Organizer
      日本人類遺伝学会第60回大会
    • Place of Presentation
      京王プラザホテル(東京都新宿区)
    • Year and Date
      2015-10-14 – 2015-10-17
  • [Presentation] A novel evaluation method for survival motor neuron protein as a biomarker of spinal muscular atrophy2015

    • Author(s)
      Masayuki Arakawa, Reiko Arakawa, Kayoko Saito
    • Organizer
      BIT's 8th Annual World Protein &Peptide Conference
    • Place of Presentation
      南京(中華人民共和国)
    • Year and Date
      2015-04-25 – 2015-04-28
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Patent(Industrial Property Rights)] SMNタンパク質の発現を検出する方法2015

    • Inventor(s)
      荒川玲子、斎藤加代子、荒川正行、野本明男
    • Industrial Property Rights Holder
      荒川玲子、斎藤加代子、荒川正行、野本明男
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      PCT/JP2015/060662
    • Filing Date
      2015-04-03
    • Overseas

URL: 

Published: 2017-01-06  

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