2014 Fiscal Year Research-status Report
MELAS患者由来のiPS細胞から分化誘導した神経細胞でのmtDNA修復の試み
Project/Area Number |
26860831
|
Research Institution | Fujita Health University |
Principal Investigator |
松本 祐嗣 藤田保健衛生大学, 医学部, 助教 (50726651)
|
Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
|
Keywords | ミトコンドリアDNA / MELAS / iPS細胞 |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ミトコンドリアDNA(mtDNA)に変異を有することで発症するMELAS(=ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群)の根本的治療法の開発を目的としている。2013年に「ゲノム編集」のツールの一つであるTranscription Activator-like Effector Nuclease (TALEN)を利用して、変異のあるミトコンドリアDNA(mtDNA)特異的にDNA二本鎖切断(DSB)を導入することで、ミトコンドリア病の原因となる変異mtDNAを減少させ、ミトコンドリアの機能回復を誘導できるということが報告された。そこで本年度は、MELASの原因遺伝子変異の1つを特異的に認識し、切断するTALENの構築を行った。 まず、変異部位を含む標的領域に結合し、二本鎖切断を誘導するTALENを設計した。続いて、設計したTALENを発現させるためのプラスミド作製を行った。選定した標的配列に対応するモジュールの連結にはGolden Gate法(Genes Cells. 18, 315-26, 2013)など、分子生物学的手法を駆使して、2ステップで行った。最後に、SSAアッセイ(HEK293T細胞にTALENおよびレポータープラスミドを導入し、ルシフェラーゼアッセイにより活性を評価)によりTALENの切断活性の評価を行った。今後、変異mtDNAを持つ細胞において、作製したTALENの切断効果を検証していく予定である。
|
Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
提出した研究計画に従い、おおむね順調に研究を遂行している。
|
Strategy for Future Research Activity |
平成26年度に得られた結果を基にして、構築TALENの変異ミトコンドリアDNA切断に対する効果の検証を行う。 (i) MELAS患者皮膚線維芽細胞より作製した iPS細胞(MELAS-iPS細胞)にTALENをLipofection等により導入して、変異mtDNAの減少効果を検証する。 (ii) MELAS- iPS細胞をSFEBq法により、グルタミン酸作動性神経細胞を主とする神経細胞への誘導を行う。分化誘導した神経細胞にTALENを導入し、変異mtDNAの減少効果を検証する。
|
Causes of Carryover |
研究はおおむね予定通り進展している。TALENの作製が一先ず完了したので、10万円程度の余剰金が出来た。
|
Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の計画の遂行にあたり、消耗品費として、細胞培養に必要な培地、プラスチック用品および試薬; 遺伝子導入実験、分子生物学実験、生化学実験、免疫組織化学実験等に使用するプラスチック用品、実験試薬、抗体の購入等に使用する予定である。
|
Research Products
(1 results)