2014 Fiscal Year Research-status Report
アトピー性皮膚炎の慢性炎症におけるS100A8/A9と新規レセプターの役割解析
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26860899
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
田中 真実(山本真実) 東京医科大学, 医学部, 助教 (60421062)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アトピー性皮膚炎 / S100A8/A9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アトピー性皮膚炎の原因究明には、皮膚バリア破綻に起因する炎症の惹起とその慢性化に至るメカニズムの解明が重要であると考える。これまでに、報告者らは皮膚の慢性炎症に関わる因子について検討してきた結果、S100A8/A9がケラチノサイトに対し一連の炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を誘導し、さらにこれらの因子がS100A8/A9を誘導する現象を見出した。このことから、S100A8/A9は皮膚バリア破綻後の炎症の慢性化に重要な役割を果たすと考えられる。S100A8, A9に対する新たなレセプターとして、Neuroplastin, EMMPRINを同定することができたことから、S100A8, A9とこれらの新規レセプターとの相互作用について解析を進めた。なお、本年度は産休・育休取得のため、一時研究を中断した。これまでに以下の結果が得られている。
S100A8, S100A9とその新規レセプターNeuroplastin, EMMPRINの相互作用の検討；S100A8/A9の細胞増殖への関与について、ケラチノサイトにおけるこれらのレセプターをノックダウンし、S100A8/A9刺激による細胞増殖の変化を比較した。その結果、いずれかのレセプター単独でのノックダウンでは、増殖抑制効果は有意ではあるものの極低いレベルに留まっていたが、同時に両方のレセプターを抑えた場合、増殖が強力に抑制された。また、これらレセプターの生体内におけるオリゴマー形成について、アトピー性皮膚炎患者皮膚切片上で、Proximity Ligation Assay（PLA）法を用いて検討した。これらのレセプター同士の反応が、皮疹部の顆粒層付近に最も強く認められた。また、増殖の著しい部位においては、基底層付近にも陽性反応が認められ、レセプター同士もheterodimerを形成している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は産休・育休取得のため一時研究を中断したが、S100A8, A9とその新規レセプターとの相互作用について検討し、その結果は米国研究皮膚科学会（SID）で発表された。
研究実績においても示したように、最も重要な発見は、リガンドであるheterodimer 化したS100A8/A9 (calprotectin)に加えて、我々が見出したそれぞれの新規レセプターであるNeuroplastinとEMMPRINもまたheterodimer を形成し、新たなレセプターとして機能するということを示した点にある。S100A8およびS100A9が生体内でheterodimerを形成し、安定化すると推定されているが、レセプターについては、S100の一般的レセプターと言われているRAGEか、S100A8が結合することが知られているTLR-4との関連で論じられてきた。我々の発見は、これまで考えられてきたS100蛋白の生理機能の更なる解明に寄与するものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
①S100A8/A9とそのレセプターの信号系の解析；S100A8, A9と新規レセプターの反応に関与するアダプター蛋白の同定、およびアダプター蛋白の発現抑制に伴うS100A8, A9誘導の炎症因子への影響を検証する。
②これまでに作製した表皮特異的S100A8, A9 Tgマウスを用いて、S100A8/A9が炎症の慢性化に寄与するかin vivoにおいて検証する。また、皮膚においてS100A8やS100A9が過剰発現している状態が獲得免疫系にどのような影響を与えるのか検討する。これらの検証には、単純刺激であるSDS塗布、そして炎症・感作刺激を含むTNCB刺激にて組織学的検討を行う。特に、S100A8-Neuroplastin系は増殖亢進をもたらす可能性が推測されるので、刺激後のTgマウス皮膚をKi-67などの増殖マーカーで染色することにより、S100A8の作用をin vivoで検証する。加えて、皮膚組織を採取しcDNA合成を行い、Th1およびTh2サイトカインに発現変化がないかqPCRにより調べる。
また、培養ケラチノサイトを用い、S100蛋白刺激後の蛋白サンプルを継時的に取得し、電気泳動後、MAPKの燐酸化(活性化)について検討する。特にp38に影響がある場合、Th2細胞への分化に必須の転写因子であるGATA-3の活性化を誘導する可能性が高いので、GATA-3に対する燐酸化についても検討を加える。
③アトピー性皮膚炎（AD）患者の皮疹部および無疹部から得られた組織切片を用い、S100A8, S100A9, 燐酸化GATA-3に対する抗体を用いて、実際にAD患者皮膚でGATA-3の燐酸化が亢進しているか、またTh2細胞の表面マーカーに対する抗体を用いて免疫染色により検討する。
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| Causes of Carryover |
産休・育休による中断のため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験に必要な細胞培養関連試薬、DNA, RNA, 蛋白抽出試薬、PCR関連試薬、抗体、免疫染色関連試薬など、また、実験動物の飼育・購入に使用予定である。
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