2015 Fiscal Year Research-status Report

ヒト終末呼吸ユニット(TRU)上皮幹細胞分離・培養と肺腺癌発がんメカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	26861134
Research Institution	National Cancer Center Japan
Principal Investigator	山田健二国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 外来研究員 (70645069)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	肺癌 / TRU-type 肺腺癌 / TTF-1 / p63 / 組織幹細胞 / 初代培養 / 培養法 / 発がんモデル
Outline of Annual Research Achievements	1.TRU上皮幹細胞の分離・培養新規培養法の開発により、従来長期培養が困難であったヒトTRU由来(TTF-1陽性)細胞の培養に成功した。この培養条件下では2種類のTTF-1陽性細胞を樹立することが可能であった。1つはTTF-1単独陽性、もう1つはTTF-1/p63共陽性というユニークな形質を示した。シングルセルクローニングの結果、前者は後者から分化することが明らかになった。ヒト成体肺では、TTF-1/p63共陽性細胞はTRUの入口部の終末細気管支から細気管支のClub細胞と密接に接して存在していることを明らかにした。 2.幹細胞性維持に必要なnicheの解明 TTF-1/p63共陽性細胞はin vitroでWnt3AとR-Spondin1のconditioned medium添加により、telomerase活性を維持し、通常の複製限界を超え、100 population doublingsを超えるまで培養・維持可能であった。また培養維持のためにⅠ型TGFβ受容体阻害物質であるA83-01の添加が重要であった。 3.TRU上皮幹細胞を用いたTRU-type肺腺癌モデルの作成 hTERTを導入したTTF-1単独陽性細胞およびTTF-1/p63共陽性細胞を元にEGFRL858R、EML4-ALKなどの肺腺癌におけるdriver oncogeneを誘導性に発現できる細胞をレトロ/レンチウイルスを用いて作成した。これら細胞を用いて免疫不全マウスへの腎被膜下移植の予備実験を行い、誘導性に発現させたがん遺伝子依存的に腫瘍形成能があることを確認したが、ヒト臨床検体に見られるのと同様の組織像は得られなかった。発がん促進のためにHPV16E6/E7とcMYCも同時に発現させたために低分化な腫瘍が形成されたものと考え、EML4-ALKのみを誘導性に発現する細胞を作製し、再度実験を行う方針とした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 幹細胞性維持に必要なnicheの解明に関しては、in vitroでの長期培養に重要な因子がWntシグナルの活性化とTGF-βシグナルの阻害であることが明らかになった。これらのシグナルに関連する分子の成体肺内での発現に関してRNAscope(R) (次世代のRNA in situ hybridization)を用いた検討を開始したが、技術的な問題で良好な結果が得られなかった。残りの予算と研究期間内で生体内でのnicheについての解析結果を得ることは困難と判断し、今回の研究では断念することとした。 TRU-type肺腺癌モデルの作成に関しては、免疫不全マウスへの腎被膜下移植の予備実験にて、hTERT導入TTF-1陽性細胞(2種類)に誘導性に発現させたがん遺伝子依存的に腫瘍形成能があることを確認したが、ヒト臨床検体に見られるのと同様の組織像は得られなかった。発がん促進のために肺腺癌のoncogene (変異EGFRまたはEML4-ALK)に加え、HPV16E6/E7とcMYCも同時に発現させたために低分化な腫瘍が形成されたものと考え、EML4-ALKのみを誘導性に発現する細胞を作製し、再度実験を行う方針とした。上記のような研究上の理由に加え、平成27年度は研究代表者のその他の業務の多忙につき、研究遂行に想定以上に時間を要したこと、また論文投稿のために追加(再現)実験を施行することとしたため、研究が遅延した。そのため、科研費の補助事業期間を1年延長した。
Strategy for Future Research Activity	これまでにTTF-1陽性のTRU-typeの2種類の上皮細胞の培養法に関しては概ね方法が確立した。遺伝子導入なしに長期培養維持が可能となり、長期培養に重要な因子を明らかにしたことから、培養維持する細胞集団中に幹細胞性をもつ細胞を高率に濃縮する方法を確立したことになる。しかし、さらにこの中から厳密に幹細胞性を有する単一細胞を同定することは、平成28年度の研究期間終了までに達成することは困難であると見込まれる。TTF-1/p63共陽性細胞が2分化能(TTF-1/p63共陽性細胞自身の自己複製とTTF-1単独陽性細胞への分化能)を有することを示す確固たる実験結果を得ること、そしてこれらの細胞の生体内での対応細胞に関して言及するためのデータを得るところまでを研究期間終了までの目標とした。
Causes of Carryover	研究代表者のその他の業務の負担増加に伴い研究遅延が生じたことから、科研費の補助事業期間を1年間延長し、研究予算を繰り越したため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	1) シングルセルクローニングにより樹立したTTF-1/p63共陽性細胞のサブクローニング(シングルセルクローニング)実験に必要な試薬に用いる。 2) 2種類のTTF-1陽性細胞の細胞分化について検討するための、タンパク・mRNA発現解析試薬に用いる。 3) 論文投稿、学会発表の経費に用いる。