Isolation and culture of human terminal respiratory unit epithelial stem cells and elucidation of underlying tumorigenesis mechanisms of lung adenocarcinoma

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26861134
• Research Institution: National Cancer Center Japan
• Principal Investigator: 山田 健二 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 外来研究員 (70645069)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 肺癌 / TRU / TTF-1 / p63 / 組織幹細胞 / 初代培養 / 培養法 / 発がんモデル

Outline of Annual Research Achievements

1.TRU上皮幹細胞の分離・培養
新規培養法の開発により、従来長期培養が困難であったヒトTRU由来(TTF-1陽性)細胞の培養に成功し、2種類のTTF-1陽性細胞が含まれていることが明らかとなった。1つはTTF-1単独陽性、もう1つはTTF-1/p63共陽性というユニークな形質を示した。シングルセルクローニングの結果、前者は後者から分化することが明らかになった。ヒト成体肺では、TTF-1/p63共陽性細胞はTRUの入口部の終末細気管支のClub細胞と密接に接して存在していることを明らかにした。
2.幹細胞性維持に必要なnicheの解明
TTF-1/p63共陽性細胞はin vitroでWnt3AとR-Spondin1のconditioned medium添加により、telomerase活性を維持し、通常の複製限界を超え、100 population doublingsを超えるまで培養・維持可能であった。また培養維持のためにⅠ型TGFβ受容体阻害物質であるA83-01の添加が重要であった。
3.TRU上皮幹細胞を用いたTRU-type肺腺癌モデルの作成
hTERTで不死化させたTTF-1単独陽性およびTTF-1/p63共陽性細胞を元にEGFRL858R、EML4-ALKなどの肺腺癌のdriver oncogeneを誘導性に発現できる細胞をレトロ/レンチウイルスを用いて作成した。これらの細胞を免疫不全マウスへ移植し、誘導性に発現させたがん遺伝子依存的に腫瘍形成することを確認したが、ヒト臨床肺癌検体と同様の組織像は得られなかった。発がん促進のためHPV16E6/E7とcMYCも同時に高発現させたために低分化な腫瘍が形成されたものと考えられた。そのため最終年度はEML4-ALKのみを誘導性に発現させるためのレンチウイルスを作成した。次期研究課題(16K21648)にて再度細胞に導入し検討する。