2015 Fiscal Year Research-status Report
霊長類(マーモセット)脳梗塞に対するヒトiPS細胞由来神経幹細胞を用いた移植治療
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26861165
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
井上 賢 慶應義塾大学, 医学部, 共同研究員 (70445378)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 霊長類 / 脳梗塞モデル / PET / 移植治療 / 神経幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス脳梗塞に対するマウス及びヒトiPS細胞由来神経幹細胞(iPSC-NS/PC)移植により機能回復が促進することが近年明らかになってきており、また中枢神経系の疾患として脊髄損傷では、サルに対するヒトiPSC-NS/PC移植により、その安全性および有効性が確認されている。しかし、脳梗塞では、霊長類を用いた実験の報告がない。臨床応用に際し重要である、前臨床研究の最終段階としてのサル脳梗塞に対するヒトiPSC-NS/PC移植を行うことで、その安全性および有効性を検討する。
これまでの検討で、マーモセットに対する低侵襲の一過性右中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルを確立し、小動物用MRIと小動物用PET(positron emission topography)を用い、マーモセットの脳梗塞および脳内の代謝変化の観点からin vivoにおいて霊長類脳内の虚血後の自然経過を観察し、MRIとPETの差からペナンブラを推定し、移植治療のターゲットとできるようになった。
マーモセット脳梗塞を作成し、亜急性期（10～14日）において細胞移植を行うにあたり、依然として解明されていないマーモセットの免疫機構の問題があり、免疫抑制剤の使用を含め、検討事項が増えてしまうため、まず同種のNS/PCの移植を行うことで、その治療効果を研究することとした。移植部位はPET撮影を用いて評価し、脳梗塞巣の辺縁とする。移植細胞はマーモセット胎児のNS/PCとした。観察期間は自然回復の見られる5～6週とし、移植群がコントロール群と比べ、機能回復が促進するかどうか行動評価および画像評価にて調べた。その後、組織学的評価を行っている。今後、移植後長期飼育も行い、腫瘍化の有無など、安全性も評価する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
【低侵襲一過性中大脳動脈閉塞(MCAO)モデル作成】ヒトの病態に近似した開頭を必要としない低侵襲脳虚血モデル、すなわち血管内手術による中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルを作成する。成熟マーモセット(年齢半年以上５年未満、体重およそ300g)を使用し、全身麻酔下に右頚部動脈を剖出し、外頸動脈から内頸動脈を経由し右MCAに塞栓糸を挿入、喫入させる。術中画像検査にてMCAに血流が無いことを確認し、3時間閉塞させた。血流遮断後、塞栓糸を抜去し縫合閉創した。術後経時的に頭部MRI撮影と行動学的評価した。
【PET(positron emission topography)での脳梗塞評価の確立】PETに用いた核種は、ミトコンドリアのComplex1での酸化的リン酸化を評価するBCPP-EF（浜松ホトニクス作成）を用いて脳梗塞を評価した。
【脳梗塞モデルに対する定位手術での細胞移植療法】ヒトにおける脳梗塞巣は、責任血管や側副血行路の違いで様々な場所に生じうる。移植治療に当たり正確な部位に細胞を注入する必要がある。マーモセットでも同じく、移植部位の決定とそこへの細胞の注入が必要となるため、PET-CTとMRI画像を融合させた画像にて定位的に細胞を移植した。移植細胞としてはマーモセット胎児由来の神経幹細胞を100万個とした。移植後のPET にて腫瘍化は認めず。5~6週間でサクリファイスし、脳切片を現在評価中。なお、移植個体は2匹、コントロールは１匹としている。
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| Strategy for Future Research Activity |
[組織学的評価]昨年度の検討が不十分であった免疫組織学的検討を引き続き行う。脳を摘出し、移植片の生着の有無、梗塞巣の変化、ホスト細胞との神経回路網再構築の可能性、腫瘍形成能を評価する。そのためにHE染色、ならびに抗NeuN、GFP（移植細胞にはあらかじめGFP遺伝子を導入してある）、 Synaptophysin抗体等を用いた免疫染色を行う。
［成果の発表］これまでの結果について論文を作成することと学会で発表することを行っていく。論文にするにあたり必要な追加実験を行っていく。
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| Causes of Carryover |
当該年度に購入を予定していた実験動物のマーモセット（１匹約40万円）を購入しなかったため、2匹分の金額が生じているため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験に使用しているマーモセットは、現在、共同研究者である慶應義塾大学生理学教室岡野研において供与して頂いているが、年間10数匹であり、手術の成功率やマーモセットの生存率を鑑みると、個体の今後の移植実験にて必要なマーモセットが全く足りてない。マーモセットの購入を最優先に行う。
また、引き続きPETを有する（株）浜松ホトニクスにて実験を行うが、浜松にある施設であり、実験者の出張費としても使用する。
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