骨芽細胞および骨肉腫における、非古典経路のWnt5aの役割の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26861181
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 岡本 正則 信州大学, 医学部附属病院, 助教(診療) (50596781)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: Wntシグナル / Wnt5a / Lrp5/6 / 骨代謝 / 骨肉腫

Outline of Annual Research Achievements

平成26年度は研究計画3年間の初年度として、まずマウス頭蓋冠由来の骨芽細胞系細胞を用いたex vivo実験を行った。予備実験の結果からWnt5aがLrp5/6の発現を制御し、Wnt古典経路を調節する可能性が示唆されていたため、本年度はまず①Wnt5aによるLrp5/6の発現制御機構の解析および、②Wnt5aの古典経路活性化作用の解析を計画していた。
①に関しては、野生型マウス由来の骨芽細胞にウイルスを用いてWnt5aをノックダウンすることで、Lrp5/6の発現が低下することを確認した。そして、Wnt5a欠損マウス由来の骨芽細胞ではLrp5/6の発現が抑制されており、リコンビナントWnt5aで刺激することで、Lrp5/6の発現が回復した。Lrp5/6の発現はリアルタイムPCRを用いてメッセンジャーRNAレベルで、ウェスタンブロットを用いてタンパクレベルで確認した。
②に関しては、Wnt5a欠損マウス由来の骨芽細胞において、石灰化能およびRunx2やSp7などの骨芽細胞分化に必須の転写因子の発現が低下すると同時に、Wnt古典経路の標的遺伝子であるAxin2の発現、古典経路活性を示すTcf/Lef活性、および細胞内βカテニンレベルが低下していることを確認した。そしてWnt5a欠損マウス由来の骨芽細胞にウイルスを用いてLrp5を過剰発現させることにより、低下した石灰化能、骨芽細胞分化能を促進することを確認した。
当初予定していた①②に関する解析が計画以上に進展していたため、平成27年度に予定していた③Wnt5aがLrp5/6の発現を制御するメカニズムについての解析を行った。
③に関してはWnt5a欠損マウス由来の骨芽細胞ではSp7の発現が低下しており、またSp7の過剰発現でLrp5の発現を回復させることから、Wnt5aはSp7を介してLrp5の発現を誘導することが示唆された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

研究実績の概要でも述べたように、当初平成26年度に予定していた研究計画は順調に進展し、平成27年度に予定した研究計画の一部まで達成することができた。
また、これまでの途中経過を国外学会（ANZBMS 2014）で口演発表する機会にも恵まれた。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度に予定していた研究計画の一部を前倒しで実施してきたため、引き続き本年度に予定していた研究計画を遂行する。
これまでにマウス頭蓋冠由来の骨芽細胞でWnt5aによるLrp5/6の発現や古典経路への作用を確認してきた。骨肉腫においてもWnt5aが同じ作用を持つかどうか、ヒト骨肉腫細胞株であるHOSなどを用いて解析予定である。
また、平成28年度には生検・手術検体を用いて、実際の骨肉腫症例におけるWnt5aやLrp5/6の発現量を比較し、それらの関連性を解析する。そして、それらの発現と、臨床成績との関連性を解析する予定である。

Causes of Carryover

当初の研究計画よりも順調に実験が進行したため、海外学会で途中経過を発表する機会に恵まれた。そのため、次年度の予算を前倒し請求した。その後、次年度に予定していた研究を継続して行っているが、消耗品の支出がその時点での予想よりも少額で済んだため、次年度に繰り越すこととした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度使用額は平成27年度請求額と合わせて、平成27年度に予定していた研究内容を継続して遂行するために使用する。

Research Products

• [Presentation] Noncanonical Wnt5a enhances Wnt/b-catenin signaling through the up-regulation of Lrp5/6 during osteoblastogenesis (2014)
  • Author(s): Masanori Okamoto, Nobuyuki Udagawa, Teruhito Yamashita, Shunsuke Uehara, Kaoru Aoki, Hisao Haniu, Hiroyuki Kato, Naoto Saito, Naoyuki Takahashi, Yasuhiro Kobayashi
  • Organizer: ANZBMS Annual Scientific Meeting
  • Place of Presentation: MILLENNIUM HOTEL, QUEENSTOWN 9300, NEW ZEALAND
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-10