淡明細胞肉腫に対するマイクロＲＮＡを標的とした新治療法の確立

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26861182
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 永野 昭仁 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60422721)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: micro RNA / clear cell sarcoma / microarray

Outline of Annual Research Achievements

1.siRNAの作成とknockdown効率の確認：　明細胞肉腫(clear cell sarcoma; CCS)の融合遺伝子を標的としたsiRNA (siEWS/ATF1; siEA)を作成し、CCS cell lineにtransfectionしたところcontrol siRNAと比較して93%のknockdownを確認できた。
2.microarrayによるmiRNA発現プロファイル変化の同定：　control siRNAとsiEAをそれぞれtransfectionしたCCS cell lineよりtotal RNAを抽出し、microarrayでmiRNA発現プロファイル変化を確認した。結果、最も発現量がupregulateされていたmiR-3127-5pの解析を行うこととした。
3.miR-3127-5pの機能解析：　siEAのtransfectionによって発現量が変化するmRNAについてもmicroarrayを行ったところ、GATA5遺伝子の発現量が最も抑制されていた。実際にCCS cell lineにsiEAをtransfectionしGATA5　mRNA発現量をRT-PCRで確認したところ有意に減少していた。また、miR3127-5pをCCS cell lineに導入したところGATA5 mRNA発現量は有意に減少し、CCS cell line細胞増殖を抑制した。さらにwound healing assayにおいてもwound healingを遅延させることを確認した。
4.GATA5の機能解析：　GATA5に対するsiRNA (siGATA5)を作成し、CCS cell lineにtransfectionしたところ、細胞増殖は抑制された。また、wound healing assayにおいてはwound healingを遅延させていた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画書で計画していた通り、明細胞肉腫における融合遺伝子EWS/ATF1によるmicroRNAの発現プロファイルの変化を同定することができた。

Strategy for Future Research Activity

CCS cell lineに対するsiEAはmiR3127-5pをupregulateさせ、GATA5をdownregulateさせていることが確認できた。すなわち、miR3127-5pの導入、GATA5の抑制がCCS細胞増殖を抑制させ、新たな治療法となる可能性が示唆された。今後GATA5を強制発現させた際の細胞増殖速度の変化や、wound healing assayによる遊走能の変化について検討を行い、最終的にはxenograft modelを作成して治療効果を検討する予定である。

Causes of Carryover

実験計画書を作成した際に想定していたよりも順調に実験が進み、再実験などが必要でなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

GATA5の機能解析およびヌードマウスを用いたCCSのxenograft modelを作成し、in vivo治療モデルの確立を目指す。