2014 Fiscal Year Research-status Report
細胞外基質への接着に伴うΔNp63発現低下を介した膀胱癌の浸潤転移機序の解明
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26861268
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
吉田 栄宏 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (80583624)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | delta N p63 alpha / cell cluster / cell adhesion / eextracellular matrix / urothelial cancer |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度はΔNp63α蛋白の発現調整メカニズム、および尿路上皮癌スフェロイドの機能解析アッセイ法の樹立に注力した。ΔNp63α蛋白は接着を契機に減弱するが、proteasome阻害剤により減弱が抑制されたことから、proteasomeによる分解が関与していることが明らかとなった。またGSK3阻害剤でも減弱が抑制されたことから、GSK3によるリン酸化を介したFbw7の関与が示唆された。一方、機能解析のためのアッセイ法として、in vitro尿路腔内播種モデルを樹立した。すなわち、まず不死化正常尿路上皮細胞SV-HUC-1にGFPを導入した。GFP導入SV-HUC-1をコンフルエントの状態にし、その上に尿路上皮癌スフェロイドを静置した。スフェロイド中の癌細胞は、時間とともにSV-HUC-1を排除し、直接細胞外基質に接着することを見出した。患者生体内において尿路上皮癌細胞は尿を介して尿路上位細胞に着床すると考えられており、本現象をin vitro尿路腔内播種モデルとして機能解析アッセイ法に用いることとした。
当初はCTOS法を用いて調整した初代培養癌細胞に遺伝子導入を行い、機能解析を行う予定であった。しかし、大腸癌や肺癌から調製した初代培養癌細胞に遺伝子導入を行った経験から、尿路上皮癌初代培養癌細胞はその特性のために遺伝子導入を行うことが容易ではないことが判明した。そこで遺伝子導入が容易な癌細胞株を用いることとした。本研究のきっかけとなった事象（接着を介したΔNp63α蛋白の発現調節）が癌細胞株でも生じるかを確認した。まず培養皿への接着を阻害して高密度で細胞を培養することにより、癌細胞株をスフェロイドの状態で浮遊培養が可能なことを明らかにした。さらに浮遊状態の癌細胞株スフェロイドはΔNp63α蛋白が、通常の接着培養に比べて高発現していることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ΔNp63αの発現調節のメカニズムを明らかにした。その結果、蛋白レベルでの調節であることが判明したため、予定していたマイクロアレイは実施しなかった。一方、スフェロイドを用いた新規の機能解析アッセイ法の樹立に成功した。
初代培養癌細胞での遺伝子導入は断念したものの、矛盾なく癌細胞株を実験系に組み入れることに成功した。癌細胞株は初代培養癌細胞に比較して、培養法や遺伝子導入法などを含めた扱いが容易である。すでにΔNp63α強制発現株・発現抑制株を樹立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
強制発現株・発現抑制株を用いて、in vitro尿路腔内播種モデルにおける機能解析を行う。ΔNp63αの発現変化により調節されている下流分子の発現解析を行う。一方で、接着が励起するΔNp63αの上流分子の解析を行う。並行して、臨床検体から調整した初代培養癌細胞も用いた検討も行う。非筋層浸潤癌の臨床検体を用いてΔNp63の発現免疫染色を行い、膀胱内再発との相関を検討する。また癌細胞株UMUC3を用いた経尿道注入による同所性モデルを樹立し、in vivoモデルによるΔNp63αの関与を検討する。
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