Tympanic border cellにおける内耳幹細胞の性質の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26861372
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 谷口 美玲 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (80706713)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 内耳再生 / 内耳幹細胞 / 遺伝子解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、内耳幹細胞を含むと考えられるtympanic border cellの遺伝子発現解析を行い、性質と機能を解明することである。具体的には、Laser Captured Microdissection法によって内耳の凍結切片からtympanic border cell、内耳感覚上皮などを採取し得られたサンプルからRNAを調整しcDNAマイクロアレイを用いて解析を行う。
本年は昨年に引き続き、Laser Captured Microdissection（以下LCM）を内耳の切片標本に行い、RNAを採取する方法について検討した。胎生18日、哺乳1日、哺乳4日のマウスの内耳を採取して凍結切片を作成し、特定の細胞集団（tympanic border cells, greater epithelial ridge, supporting cells）をLCM技術を用いて、回収した。昨年度の条件検討の結果に基づき、内耳の凍結切片に対してメタノール固定を行い、クレシルバイオレット染色を行った。LCMを用いて採取したサンプルからのRNAの調整には、微量RNA回収用のキットを用いた。RT-PCRにて、目的とするRNAが採取できていることを確認し、RNAの質についての解析を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

cDNAマイクロアレイに必要なRNAの質についての解析中であるが、実験結果が安定せず、解析が不十分である。さらにどのくらいの切片を用いれば、cDNAマイクロアレイを行うことができる量のRNAを採取できるかの検討をする必要がある。

Strategy for Future Research Activity

マウス内耳の凍結切片からLCMの技術を用いて採取したRNAについて、cDNAマイクロアレイの解析に適した質および量を採取できているか、引き続き、検証する。内耳幹細胞を含むtympanic border cellに特異的に発現する遺伝子を発見するため、cDNAマイクロアレイを行い、その結果の解析を行う。

Causes of Carryover

平成26年度、27年度研究経費では、マイクロアレイの実験データの蓄積・解析に用いるコンピュータを計上していたが、内耳のサンプリングや固定などの条件検討に十分な時間をかけたため、研究に遅延が生じ、マイクロアレイの準備については次年度に行うこととした。また、国内学会にて本研究成果についても次年度以降に行う予定とした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度からマイクアレイの解析を開始する予定である。消耗品費については、動物の経費に加え、マイクロアレイに必要な試薬などを計上している。平成28年度以降は前年度の結果を含めた成果の公表の増加を考え、国際学会、国内学会、論文投稿などに関連する諸費用を旅費、謝金、その他に計上している。前年度の未使用額はこれらの経費に充てることとする。