2014 Fiscal Year Research-status Report
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26861462
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
永田 真帆 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (40614102)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | R-spondin1 / 角膜 / 創傷治癒 / 細胞間接着 / 細胞増殖 / 幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RSPO1遺伝子欠損マウスモデルを用いた角膜における機能解析
1. 形態学的・組織学的検討 KOﾏｳｽの形態学的特徴を継時的に観察した結果、生後6か月で角膜混濁を生じ徐々に増強することが確認された。この角膜にﾌﾙｵﾚｾｲﾝ染色を行うとdelayed stainingが生じ、角膜上皮の透過性亢進が明らかとなった。
2．細胞生物学的検討 生後1年のﾏｳｽ角膜を組織学的検討した結果、混濁の原因は角膜上皮下の沈着物であり、さらにｶﾙｼｳﾑ染色により、沈着部にｶﾙｼｳﾑ塩を含むことが判明した。細胞骨格ﾏｰｶｰ（ｹﾗﾁﾝ等）、細胞間接着分子（ZO1等）、基底膜構成分子（ﾗﾐﾆﾝ等）の発現を免疫組織化学的に調べた結果、細胞骨格ﾏｰｶｰの異常は認めず、角膜上皮としてのｷｬﾗｸﾀｰを維持していると考えられた。角膜上皮透過性亢進所見から、細胞間接着分子の異常が予想されたが、やはり発現低下していた。基底膜は肥厚し、基底膜が沈着部位であると考える。角膜混濁発生の機序として、角膜上皮接着分子が破綻し、涙液が基底膜まで移行して涙液中のｶﾙｼｳﾑがpH変化などによりﾊｲﾄﾞﾛｷｼｱﾊﾟﾀｲﾄのような結晶構造となり沈着したことが考えられる。
3．角膜創傷ﾓﾃﾞﾙによるRSPO1のin vivo機能解析 WTﾏｳｽとKOﾏｳｽに角膜創傷を作成し創傷治癒を比較したところ、KOﾏｳｽで有意に角膜創傷治癒が遅延し、RSPO1が創傷治癒に寄与している可能性が示唆された。WTﾏｳｽの角膜創傷ﾓﾃﾞﾙで経時的に組織を採取し、免疫組織化学的手法でRSPO1、細胞増殖ﾏｰｶｰの発現を確認した。その結果、RSPO1は創傷へmigrateしている上皮では発現低下し、細胞増殖・再構築の段階で再発現することが確認された。RSPO1は上皮再構築に関与している可能性が示唆され、これが創傷治癒促進作用の理由のひとつであると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RSPO1はﾒｽの性腺形成に必須であり、KOﾒｽは妊娠不可能、ﾍﾃﾛﾒｽは乳腺発達障害のため授乳不能で育児放棄する。そのため譲り受けたﾍﾃﾛﾏｳｽにより系統維持とKOﾏｳｽ産出を行う。KO仔ﾏｳｽを得るためには、ﾍﾃﾛ同志を交配し1/4の確率でKO仔ﾏｳｽを得るが、出産したﾒｽはその後育児しない。そのため、WTﾏｳｽを同時期に交配し、産後すぐにﾍﾃﾛﾏｳｽの仔をWTﾏｳｽｹｰｼﾞに移しWTﾏｳｽに育児させた。しかし、出産時期がずれることも多く、同時期に出産しても産後すぐにﾀｲﾐﾝｸﾞよく仔ﾏｳｽを移動することが困難で、ﾀｲﾐﾝｸﾞよく移動してもなかなか別ﾏｳｽの仔を育児するに至らない。また、WTﾏｳｽが出産した仔ﾏｳｽと区別不能でgenotype PCRが非効率である。そこで、多産系統（ICR）ﾏｳｽを同時期に交配し、同ｹｰｼﾞで同時期に出産させ、両系統の仔ﾏｳｽをICRﾏｳｽに育児させた。この方法により、ICRﾏｳｽが匂いの違いで育児放棄することも減り、ﾍﾃﾛの出産後すぐにICRﾏｳｽから授乳可能となった。仔ﾏｳｽの色とｻｲｽﾞの違いが明らかであり、同ｹｰｼﾞ中でもﾍﾃﾛﾏｳｽから産まれた仔ﾏｳｽのみを選別しgenotype PCRを行うことができ、効率よくKOﾏｳｽを選出することが可能となった。現在は順調にKOﾏｳｽを得ている。
このような事情から、当初KOﾏｳｽ数の確保が困難だったが、その間は少ないKOﾏｳｽについての種々の実験や、KOﾏｳｽ以外の実験（WTﾏｳｽの創傷実験等）を行うことで、順調に実験結果を出し学会発表も行うことができた。また、KOﾏｳｽの長期経過観察と組織学的実験の中で数々の発見があり、RSPO1の機能がさらに明らかとなってきた。新たな知見が蓄積されるにつれ、今後行うべき実験や課題がわかってきた。総合すると、順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初RSPO1は種々の組織幹細胞ﾏｰｶｰであるLGR5のﾘｶﾞﾝﾄﾞであることから、幹細胞関連の役割を想定し実験開始した。昨年度の結果では、RSPO1の創傷治癒促進効果が明らかとなり、とくに再構築期の増殖・分化への関連が示唆された。一方、KOﾏｳｽの長期経過観察では徐々に角膜混濁が増強し、細胞間接着分子の破綻によるｶﾙｼｳﾑ沈着が観察され、RSPO1が角膜上皮分化過程での細胞間接着構成に関与すると考えられた。
したがって、今年度の課題は、RSPO1の角膜における増殖・分化に関する機能解析となる。
1.形態学的・組織学的検討 RSPO1-KOﾏｳｽの組織を採取し、微細構造（細胞間接着等）について電子顕微鏡を用いて検討する。
2.分子生物学的検討 RSPO1-KOﾏｳｽ角膜上皮の細胞間接着関連分子（ZO-1、ｸﾛｰﾃﾞｨﾝ、ｵｸﾙｰﾃﾞｨﾝ、ﾃﾞｽﾓﾌﾟﾗｷﾝ等）について免疫組織化学的検討を行い、どの細胞間接着が破綻しているのかを調べる。RSPO1の創傷治癒促進作用に関連して、増殖、アポトーシス、炎症関連の分子についても免疫組織化学的検討をすすめる。
3.角膜創傷ﾓﾃﾞﾙによるRSPO1のin vivo機能解析 KOﾏｳｽの角膜に創傷を作成し、継時的に組織を採取し、組織修復過程におけるWTﾏｳｽとの違いについて検討する。具体的には、増殖、アポトーシス、炎症関連分子について免疫組織化学的検討をすすめる。
4.RSPO1のin vitro機能解析 RSPO1-KOﾏｳｽより採取した角膜上皮細胞を培養、重層化させ、角膜上皮層上／下の電気抵抗を測定し、WTﾏｳｽと比較することで、培養角膜上皮の透過性を調べる。同様に3次元構築したﾏｳｽおよびﾋﾄ角膜上皮にﾚﾄﾛｳｲﾙｽﾍﾞｸﾀｰを用いてRSPO1を遺伝子導入し、ﾏｳｽおよびﾋﾄ角膜上皮のin vitroにおける機能解析を行う。
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Research Products
(3 results)
