2014 Fiscal Year Research-status Report
脱分化軟骨細胞Lineage tracing法開発による軟骨細胞脱分化過程の解析
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26861496
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
峯岸 芳樹 福井大学, 医学部附属病院, 助教 (10467566)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 軟骨細胞 / 脱分化 / lineage tracing |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ES細胞やiPS細胞からの各種臓器細胞の分化誘導やダイレクトリプログラミングによる線維芽細胞からの分化など近年のtissue engineeringの技術の進歩は大きい。軟骨細胞においては変形性膝関節症や小耳症の分野で臨床応用が期待される。
細胞数を増やすために初代軟骨細胞培養を行うと増殖の過程で脱分化を起こしてしまうことが知られており、本研究では軟骨細胞脱分化の過程をlineage tracingの手法を用いて観察し、脱分化のメカニズムの解析を行う。
今まさに軟骨細胞である細胞がGFP陽性となるCol11a2-EGFPマウスと今まさに軟骨細胞である細胞とかつて軟骨細胞であった細胞がYFP陽性となるCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスの2種類のマウスから採取した初代培養軟骨細胞の培養過程における蛍光性の差異から軟骨細胞から脱分化した細胞を割り出すことが可能となる。
軟骨細胞ではその培養法や添加薬物により軟骨としての性質維持や脱分化が繊細に起こるため本年度の研究ではまず野生型マウスの関節から軟骨細胞を高純度で分離する手法を確立した。分離した軟骨細胞は初代培養を行い、1週間かけて細胞増殖するにつれて、細胞形態の変化を起こしていく培養条件の検討を行った。これによりCol11a2-EGFPマウスとCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスの軟骨細胞を使用したtime-lapse撮影での蛍光性の変化を観察するための最適培養環境を決定した。
今後は初代軟骨細胞培養過程における線維化マーカーや軟骨マーカーを追跡することで軟骨細胞脱分化のメカニズムの解析をreal time PCR、マイクロアレイを行って解明していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の成果として軟骨細胞脱分化の観察に必要となる軟骨細胞を供給するCol11a2-EGFPマウス、Col11a2-Creマウス、Rosa-stop flox-EYFPマウスの系統維持を行い、さらにCol11a2-CreマウスとRosa-stop flox-EYFPマウスとを交配したCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスを作成した。その上でのCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスのホモマウスの作成および系統維持を行った。これにより実験により必要なマウスを逐次使用できる環境が整った。
また生後5日齢の野生型マウスの肋軟骨および大腿骨頭、膝関節軟骨から軟骨細胞を採取する方法を確立した。そこから単離した初代軟骨細胞の単層培養下での培養液、播種細胞数、添加薬剤の種類・濃度などの培養条件の検討を行った。time-lapse観察を行う上で軟骨細胞がconfluentにならずに細胞増殖していく期間を調整することとその間の細胞形態変化を捉えることができる条件を見出すことに当初の予定より日程を要した。
上記で検討した初代軟骨細胞培養条件下でCol11a2-EGFPマウスおよびCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスの大腿骨頭、膝関節軟骨から採取した軟骨細胞を用いて脱分化の過程が追跡できるかを検討しているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度および平成28年度の今研究の推進方策としては、まずCol11a2-EGFPマウスおよびCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスの系統維持・繁殖を引き続き行う。Col11a2-EGFPマウスは今まさに軟骨細胞である細胞がGFP陽性に、Col11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスは今まさに軟骨細胞である、もしくはかつて軟骨細胞であった細胞がYFP陽性になると考えられる。それぞれのマウスが3週齢の段階で膝周囲の組織の中（関節軟骨・成長板軟骨・二月骨化中心・半月板・筋肉・靭帯・皮膚など）でどの部位に蛍光性を認めるかを凍結切片を作成して確認する。
平成26年度に検討した初代軟骨細胞が適切に脱分化していく条件下の実験系において、Col11a2-EGFPマウスおよびCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスから採取した軟骨細胞を実際に使用して細胞培養過程をtime-lapse撮影を行い、その際の軟骨細胞の細胞増殖、形態変化、蛍光性の変化に関して観察する。また培養の初期かた中期・後期にかけての各段階でmRNAの回収を行い、線維化のマーカー、軟骨細胞のマーカーのreal time PCRを行うことで脱分化過程の解析を行う。
軟骨細胞脱分化を制御する候補遺伝子の候補が上がってくれば、強制発現や強制抑制の実験を行うことで軟骨細胞脱分化のメカニズムの解析を行う。
得られた知見をまとめて国内外の学会において発表し、論文投稿の準備を進めていく。
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| Causes of Carryover |
Col11a2-EGFPマウスはその一つの系統だけで実験に使用することができるが、Col11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスは必要とされる表現型を獲得するために二つの系統を掛け合わせる必要があった。またホモマウスにすることで安定して供給するための効率があがるため、その経過において当初の予定より時間を要した。
またマウスの初代軟骨細胞培養において脱分化の観察を行うための培養条件の検討で検討項目が多く、時間を要した。
上記の2つの理由によりCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスを用いた初代軟骨細胞脱分化観察の実験が当初より遅れたことが次年度使用額が生じた理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在の状況は当初の計画通りにまでほとんど追いついてきており、今年度の研究費を使用して初代軟骨細胞の培養に必要な培養液や添加物・薬品の購入、培養皿やピペットなどの実験機器の消耗品の購入や、real time PCRを行う際に必要となるプライマーや各種の実験キットの購入を行う。本年度の計画通りに実験を進行できれば軟骨細胞脱分化を制御する遺伝子をマイクロアレイを用いて解析していくための実験費用が必要となる。
また実験から得られた成果を発表し、最新の知見を情報収集するために各種学術集会に参加するための旅費を計上する予定である。
成果がまとまり次第、論文執筆を行い、その校正や投稿を行っていく。
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Research Products
(2 results)
