次世代シークエンサーによるインプラント周囲細菌叢の網羅的解析と個別化抗菌療法開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26861637
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 大野 彩 (木村彩) 岡山大学, 大学病院, 助教 (20584626)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 口腔インプラント / インプラント周囲炎 / 細菌叢 / 次世代シークエンサー

Outline of Annual Research Achievements

平成26年度にサンプリングしたインプラント周囲炎患者5名（診査時平均年齢：71.0歳，男性／女性：2／3名，平均インプラント体埋入本数：4.8本，感染インプラント体周囲の平均プロービングデプス値：5.6mm）の感染インプラント周囲滲出液，健全インプラント周囲滲出液，天然歯周囲滲出液から，16SrRNA解析に供するDNAの回収が，個体差やサンプル量の影響を受けずに可能であることを確認した．また，シークエンス前に実施するPCRの非特異的な増幅が結果に大きな影響を与えるため，増幅の妥当性を確認できる高感度DNA検出キットを用い，非特異的な増幅が起きていないことを確認した．
また本年度は，細菌叢の16SrRNA解析に供する検体の採取を行った．当初サンプリングした5名は滲出液のみを採取していたが，細菌叢解析においては，細菌叢の標準化のために自然唾液が必要となる．そこで，対象者のインプラント周囲炎罹患インプラント体，健全インプラント体，健全歯および歯周病罹患歯それぞれの周囲ポケットからペーパーポイントを用いて歯肉溝浸出液を採取し，加えて自然唾液を採取した．自然唾液は日内変動が大きいため，最も安定している「朝食もしくは口腔清掃後2時間以降経過した午前中」の条件下でサンプリングした．
H28年3月末までに，6名（診査時平均年齢：64.7歳，男性／女性：1／5名，喫煙／非喫煙：2／4名）からのサンプリングおよび臨床診査を終了した．口腔内の平均インプラント体埋入本数は3.9本であり，インプラント周囲炎と診断されたインプラント体本数は1.2本であった．感染インプラント体の平均機能期間は9.8年で，インプラント周囲炎と診断されたインプラント体はすべて臼歯部に埋入されており，インプラント体周囲の最深ポケット値は10mm（平均4.2mm）であった．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成27年度は，解析前のPCR条件確認を終了し，次世代シークエンサーによる細菌叢の16SrRNA解析を実施することを予定していた．昨年度に収集した滲出液サンプルにて，予定どおりPCR条件の標準プロトコールを確立することができた．H27年度にインプラント周囲滲出液と自然唾液を採取した6名には，喫煙者2名が含まれていたため，非喫煙者と喫煙者で条件が異なる可能性も考え，追加のサンプリングを行うこととした．そのため， 16SrRNA解析はまだ実施できていないが，対象者のサンプリングは進んでおり，概ね順調に進展していると考えている．

Strategy for Future Research Activity

H27年度にインプラント周囲滲出液と自然唾液を採取した6名には，喫煙者2名が含まれていたため，非喫煙者と喫煙者で条件が異なる可能性も考え，追加のサンプリング（5名予定）を行ってから16SrRNA解析を行う．昨年度のインプラント周囲炎患者は年間25名程度であり，早期に収集可能と考えている．
そして，細菌叢および臨床データの多変量解析，クラスター解析を行い，インプラント周囲炎進行のハイリスク患者を同定すること，それらの患者への感染源除去療法前後の細菌叢解析を実施する予定である．同一患者で，臨床症状の変化と歯肉溝浸出液の細菌叢の変動を見る予定であるため，平成27年度にサンプリングした6名の追跡を確実に実施する．