2014 Fiscal Year Research-status Report
Vwc2-likeによる石灰化促進メカニズムの解明と臨床応用に関する研究。
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26861671
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
大山 厳雄 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (30451975)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 骨造成 / BMP-2 / Vwc2 / Vwc2-like / 国際情報交換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
顎口腔領域の顎骨疾患に対し、骨の造成は患者のQOL向上のために非常に重要であり、現在患者自身の侵襲を伴う自家骨移植の他に、有効な方法は確立していない。また近年、骨形成促進タンパク質であるBMPの臨床応用の報告は散見されるが、その使用の有益性は確証されていない。前回、我々は骨形成タンパク質であるBMPの促進因子(Vwc2、Vwc2-like)を発見したため、今研究ではそのメカニズムを解明し、少しでも早い臨床応用を目的とする。
1.BMP-2の骨芽細胞分化促進に対するVwc2の作用の解析：細胞外タンパク質であるVwc2を培地内にBMP-2と共に様々な濃度で混入し、マウス骨芽細胞前駆細胞の細胞株であるMC3T3-E1細胞を培養。試薬処理3日目でのALPの活性、1,7,14日目でのreal-time PCRによる骨芽細胞分化や石灰化に関与する遺伝子の発現を解析。また、2週間でアリザリンレッドによって細胞外基質に形成された石灰化物を染色し、視覚的に石灰化の程度を解析。以上の実験により単に骨芽細胞に分化誘導をかけた群や、BMP-2のみを加えた群と比較してBMP-2、Vwc2併用群がより骨芽細胞分化を促進することを確認。
2.BMP-2の骨芽細胞分化促進に対するVwc2-likeの作用の解析：研究支援者より入手したVwc2-likeの発現遺伝子を大腸菌に導入、タンパク質としてのVwc2-likeを抽出、精製。その後、Vwc2と同じく細胞外タンパク質であるVwc2-likeを様々な濃度で培地内に混入、上記の実験を行い、BMP-2の骨芽細胞分化促進作用をどのように制御するか解析を行う。
3.in vivoにおけるVwc2、Vwc2-likeの骨形成能の解析：マウス頭蓋骨に軟組織生検用のトレフィンパンチで骨欠損モデルを作り、コラーゲンスポンジにBMP-2、Vwc2、Vwc2-likeを種々の濃度で含ませたものを填入。術後、μCTにて欠損部の経時的な骨形成の状態を観察。実際に生体内においてコントロールと比較しVwc2、Vwc2-likeの骨形成制御がどの程度行われているか確認。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1.BMP-2の骨芽細胞分化促進に対するVwc2の作用の解析：BMP-2、Vwc2併用しALP活性、石灰化物染色を行った。いずれもネガコン、ポジコンとも比較しても石灰化の促進に働くことが示唆された。遺伝子の発現はreal-time PCRで解析を行ったが、データ間にばらつきが生じているためより良い条件と方法を再検討する必要がある。
2.BMP-2の骨芽細胞分化促進に対するVwc2-likeの作用の解析：大腸菌にVwc2-like遺伝子プラスミドを導入し、タンパク質抽出、精製を行った。精製したタンパク質についたタグに対する抗体でウエスタンブロットを行い、目的タンパク質の抽出を確認した。Vwc2同様にMC3T3-E1細胞に作用させたが、コントロールと比較して有意な差が得られていないため、こちらも条件・方法の再検討が必要である。
3.in vivoにおけるVwc2、Vwc2-likeの骨形成能の解析：実際にマウス頭蓋骨骨欠損モデルを作成し、まずはBMP-2の指摘濃度を探るための予備実験を行っており、現在解析中である。
昨年度に行うとしていたVwc2遺伝子を直接導入したクローン細胞での実験は未遂行であるが、in vivoの実験の条件検討等今年度以降に計画していた実験を前倒しして行うことができており、概ね順調に進行していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.BMP-2の骨芽細胞分化促進に対するVwc2の作用の解析：遺伝子発現の解析において、データのばらつきをなるべく抑えるため、培養条件や試薬の指摘濃度、実験の手技やPCRで使用するプライマーに関して再検討が必要である。また、いかにしてBMP-2の作用を促進しているかのメカニズムについてもBMP-2下流の各種Smadのリン酸化やRGD配列による細胞接着関連の研究を通し、明らかにする。また、株化された細胞だけではなく、マウス頭蓋骨のPrimary cellや、外科という当科の特色を生かした手術検体より得られるヒト下顎骨Primary cellでの反応も確認する。
2.BMP-2の骨芽細胞分化促進に対するVwc2-likeの作用の解析：抽出したVwc2-likeタンパク質に活性があるのか、以前の研究で発表したreal-time PCRでのOsterix発現の上昇やAlizarin Red S染色での石灰化の亢進を確認し、Vwc2と同様のALP活性や他の骨芽細胞分化遺伝子の発現の解析を行う。幸い、実験で繰り返し使用するのに十分な量の遺伝子導入大腸菌や精製タンパク質のストックがあるのでスムーズに実験が行われると考える。
3.in vivoにおけるVwc2、Vwc2-likeの骨形成能の解析：予備実験での条件を再検討し、実際にVwc2、Vwc2-likeをBMP-2と併用投与した群とBMP-2単独で投与した群での比較検討を行う。
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| Causes of Carryover |
購入を予定していた試薬の納入価格が予想より安価であり、差額は次年度へ繰り越すこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試薬の購入、消耗品の購入に充て、次年度の実験計画をよりスムーズに遂行できるようにする。
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