転写因子Alx3による骨芽細胞分化促進作用の解明と骨造成への応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26861684
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 松本 貴志 昭和大学, 歯学部, 助教 (00635039)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: Alx3 / BMP2 / 骨芽細胞

Outline of Annual Research Achievements

１）BMPによるAlx3の発現誘導におけるシグナル伝達機構は、BMPによる主要な伝達経路であるBMP/Smad経路のDorsomorphinによる阻害、および共役SmadであるSmad4の発現抑制によりAlx3の発現が低下することから、Smad経路を介していることが明らかとなっている。その他経路を介する誘導の可能性としてMAPKにおける各阻害薬を用いて検討したところ、Smad経路と比較して有意な結果は認めなかった。
２）転写因子であるAlx3における共役因子の同定は、Alx3の機能を増幅する上で重要である。Alx3における様々な研究報告より、E47およびCart1を共役因子の候補とし、それぞれにおいて強制発現ベクター作製し、Alx3の強制発現ベクターと共に遺伝子導入したところ、BMPによる骨芽細胞文化への影響は認められなかった。共役因子の解明に関して、CHIPアレイ解析より候補因子の再度選定が必要である。
３）Alx3がBMPによる骨芽細胞分化を促進する際、その標的遺伝子を同定することは、骨芽細胞分化を促進させる分子メカニズムの解明、さらには将来的に骨造成の促進を目的とした創薬の開発に重要であると考えられる。Alx3を高発現することができるプラスミドベクターを用いたCHIPアレイによりAlx3と結合するタンパク質を網羅的に解析し、骨芽細胞分化促進に関連した標的遺伝子を同定する。標的遺伝子についてクロマチン免疫沈降法により、網羅的解析の再現性を確認する。
４）今後の展望として、Alx3のBMP活性促進因子としての臨床応用への可能性を検討する。Alx3遺伝子を導入した多能性幹細胞を用いた骨内インプラントの骨結促進法の基礎的研究として、Alx3遺伝子を発現するレンチウイルスベクターの作製、犬骨髄由来多能性幹細胞の選別およびAlx3遺伝子の細胞への導入、さらには犬脛骨への上記細胞を併用したインプラント埋入および各種解析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は昨年度に引き続き、Alx3における共役因子および標的遺伝子の探索を遂行してきたが、それぞれにおいて有効とされる候補因子について有意な結果が認められなかった。より関連性のある因子が同定できれば、円滑な研究遂行が可能であると思われる。

Strategy for Future Research Activity

Alx3の共役因子および標的遺伝子の同定として、CHIPアレイによる網羅的解析の結果データより新たな候補因子の同定を探索する。候補因子については順次同定実験を行っていく予定である。また、Alx3のBMP活性促進因子としての臨床応用への可能性を検討する。具体的な方針として、Alx3遺伝子を導入した多能性幹細胞を用いた骨内インプラントの骨結促進法の基礎的研究として、Alx3遺伝子を発現するレンチウイルスベクターの作製、犬骨髄由来多能性幹細胞の選別およびAlx3遺伝子の細胞への導入、さらには犬脛骨への上記細胞を併用したインプラント埋入および各種解析を行う予定である。

Causes of Carryover

昨年度はAlx3の共役因子および標的遺伝子の候補因子探索が主な研究となり、必要試薬や実験機材の需要が少なく、多額の次年度使用額が生じる結果となった。本年度は引き続きAlx3における共役因子および標的遺伝子の候補因子の探索を進めてきたが、Alx3は研究報告の少ない遺伝子であり、研究の参考となる情報が少数であり、同定実験が難航している。上記の事由にて補助事業期間の延長および次年度使用額が生じる結果となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

Alx3の共役因子についてはプロテインチップを用いた解析、および標的遺伝子についてはマイクロアレイを用いた網羅的解析について検討している。