口腔癌に発現する新規バイオマーカーRCAS1の機能解析と臨床応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26861730
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 豊嶋 健史 九州大学, 歯学研究科(研究院), 研究員 (20546569)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 口腔扁平上皮癌 / 膜型RCAS1 / 分泌型RCAS1 / アポトーシス

Outline of Annual Research Achievements

RCAS1は口腔扁平上皮癌（OSCC）において発現しており，免疫組織学的にTILにアポトーシスを誘導していることが証明された．ゆえに， RCAS1がOSCCのバイオマーカーとして有用であるという仮説をたてている．本研究では，in vitroでOSCC細胞におけるRCAS1の発現動態と機能について解析している．次に，RCAS1がOSCCのバイオマーカーとして有用であるかを臨床的に検討する．具体的には，①OSCC由来細胞における膜型•分泌型RCAS1の発現動態を検索する　②OSCC由来細胞が発現するRCAS1によるアポトーシス誘導能について検討する　③膜型および分泌型RCAS1がどのようにアポトーシス誘導能に影響するかを検討する　④OSCC患者の血清中のRCAS1値と臨床病理因子および臨床経過との関連を検索する　の4つである．
昨年度は，HSC-2, HSC-3, SQUU-A, SQUU-Bを培養皿に付着させた後，4日間培養を行った．膜型RCAS1の検索は付着完了時に行った．分泌型RCAS1の検索を付着完了時から1,2,3,4日後に行い，Flow cytometry法で膜型RCAS1，Dot blot法，ELISA法で分泌型RCAS1の発現を確認した．
今年度は，HSC-2, HSC-3, SQUU-A, SQUU-Bと白血病細胞株K562の共培養を行い，RCAS1によるアポトーシス誘導能について検討した．これは，細胞間接着により誘導される膜型RCAS1によるK562に対するアポトーシスを検索するものである．具体的にはOSCC由来細胞とK562を4日間共培養した．K562のアポトーシスの検索は，付着完了時から1,2,3,4日後にFlow cytometry法を用いて行った．結果として，すべてのOSCC由来細胞が発現する膜型RCAS1により，K562のアポトーシスが誘導された．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

すべてのOSCC由来細胞が発現する膜型RCAS1によりK562のアポトーシスが誘導されたことから，手技の確立がなされて安定した結果が得られているため．

Strategy for Future Research Activity

今後は，③膜型および分泌型RCAS1がどのようにアポトーシス誘導能に影響するかを検討する　④OSCC患者の血清中のRCAS1値と臨床病理因子および臨床経過との関連を検索する　ことである．特に分泌型RCAS1を検索するために，OSCC由来細胞にsiRNAを導入してターゲットであるRCAS1遺伝子をノックダウンして，膜型および分泌型RCAS1の発現が消失することをFlow cytometry法とELISA法で確認する．次にRCAS1の発現動態によるK562のアポトーシス誘導能への影響を確認するために以下の3群を用意して共培養を行い，膜型•分泌型RCAS1によるアポトーシスの程度をFlow cytometry法で測定する．
また，RCAS1がOSCCのバイオマーカーとして有用であるかを検討するために，OSCC患者の末梢血を経時的（術前、術中、術後、定期的な経過観察時）に採取し分泌型RCAS1値の測定を行い，臨床病理因子との相関を検討する．またin vitro実験系で，OSCC患者の血清中のRCAS1によるK562の増殖抑制効果を確認する．

Causes of Carryover

OSCC由来細胞株（HSC-2, HSC-3, SQUU-A, SQUU-BとK562を共培養し，K562のアポトーシスの検索をFlow cytometry法（標識抗体：Annexin V-PE）で行ったが，高価な試薬が必要であったため．

Expenditure Plan for Carryover Budget

③膜型および分泌型RCAS1がどのようにアポトーシス誘導能に影響するかを検討する，では，今までの試薬を使用できるため，新規購入が必要となることは少ないと考える．また，④OSCC患者の血清中のRCAS1値と臨床病理因子および臨床経過との関連を検索する，では臨床標本を主に使用するために，高価な試薬，物品は不要である．