2015 Fiscal Year Annual Research Report
アルカン合成酵素群の革新的活性評価法開発と高速人工進化
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26870136
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
林 勇樹 東京大学, 総合文化研究科, 助教 (90444059)
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2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 進化分子工学 / アルカン合成酵素 / バイオエネルギー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、進化分子工学的手法を用いて、2つのアルカン合成酵素（アシルACP還元酵素(AAR)とアルデヒド脱ホルミル化酵素(ADO)）の高活性化を行い、大腸菌によるアルカンの大量生産を目指した。そのために、変異体ADと変異体AARのライブラリを構築と、各タンパク質の活性を簡便、かつ迅速に検出する系の構築を行った。
平成27年度では、平成26年度に引き続き、ADの迅速、かつ簡便な活性検出法の構築を行った。ナイルレッドを使用したアルカンの検出法では、菌体由来の脂質類に反応し蛍光を示したため、アルカンの生成を有意に検出できる条件を見つけることができなかった。そのため、ADの活性を呈色反応で検出できる全く新しい系の構築を進めた。
一方で、平成26年度にAARの生成物を発光で検出する系の構築に成功しており、平成27年度は、活性に応じた発光強度が得られるようにするため、培地、大腸菌株、プロモーターの種類、発現条件の最適化を進めた。その結果、寒天培養でも液体培養でもAARの活性に応じた発光強度が得られる検出条件を決定することができた。AARの変異体ライブラリを構築し、小規模の変異体AARライブラリで活性を比較した結果、野生型AARよりも強い発光を示す変異体が見られた。このことから、本検出系を用いた進化分子工学による高活性AAR変異体を取得に有効であり、集団サイズを拡大した変異体AARライブラリからより高活性な変異体AARの取得が十分に期待できる。さらに、本検出法は菌体内の脂肪酸アルデヒド量をリアルタイムにモニターすることが可能であることから、大腸菌の代謝改変に応用し、アルカンの初期基質であるアシル-ACPをより多く供給する大腸菌の創製などに応用可能であることが示唆された。
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