2015 Fiscal Year Research-status Report
GADD34遺伝子欠損が老化に伴う２型糖尿病や脂肪肝発生に及ぼす影響の解析
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26870257
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
西尾 尚美 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (80513457)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 免疫 / 代謝 / 免疫 / 老化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
in vivoの解析
昨年度は老化に伴う肥満におけるGADD34の影響についてを中心に考察を行ったが、本年度は、脂質過剰生成の状態を作るため若齢マウスにHFDを摂餌し、WTとKOマウスで比較し脂質過剰による肥満や脂肪肝形成におけるGADD34の役割について詳細に検討した。In vivo の解析ではKOマウスでは脂肪肝形成が早く、インスリン抑制が早い段階で認められた。さらに詳細なメカニズムの解析を行うため、昨年度行ったマウスの肝臓と脂肪組織のシグナル伝達系のウェスタンブロッティングに加え、本年度は血清中の様々な因子を測定した。KOマウスでは肝臓や血中のトリグリセライドは加齢やHFD摂餌で上昇し、インスリンシグナルが亢進している若年では血中のインスリン濃度は低下し、インスリン抵抗性示した加齢やHFD摂餌では血中のインスリン濃度は上昇した。また、加齢やHFD摂餌によって血中のTNF-αの濃度が上昇している事も明らかとなった。
in vitroの解析
GADD34KOマウスで加齢やHFD摂餌によってインスリン抵抗性になるメカニズムを詳細に検討するため、MEFを用いてインスリン刺激、脂肪酸刺激などを行った。GADD34 KOのMEFではがインスリンシグナル伝達系の促進によって、MEFから脂肪細胞への分化が促進された。さらに、脂肪酸刺激によってMEFからのTNF-α産生が上昇し、TNF-αレセプター下流のJNKのリン酸化が促進し、インスリンレセプターのリン酸化を抑制する事でインスリンシグナル伝達系が抑制されることが明らかとなった。
以上のことから、GADD34 KOマウスではインスリンレセプターのシグナル伝達系が促進することによって、脂肪細胞の増殖分化が促進し、脂肪細胞が増殖する事で産生されるTNF-αも増加、TNF-αによってインスリン抵抗性が誘導される事が明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度はMEFを用いたin vitroの解析よって、GADD34 KOマウスが肥満になり脂肪肝形成するメカニズムが、インスリンレセプターのシグナル伝達系の亢進による可能性が高いことが明らかとなった。この解析の過程で、GADD34はインスリンレセプターの上流で抑制していることをつきとめた。これらの研究結果は本年度論文としてScientific Reportsに報告した。
しかし、GADD34がインスリンシグナル伝達系のどの部分に結合して、どのように働いているかについては未だ明らかにできていない。GADD34はこれまで報告で、小胞体ストレスに関与し、eIF2αを脱リン酸化することで蛋白合成のシャットオフからの回避の役割を担っているというメカニズムでは、本年度明らかにした「インスリンシグナル伝達系の抑制」は説明できない。そこで、GADD34は細胞内のどこに発現し、インスリンシグナル伝達系のどの部位で働いているのかについて現在検討を続けており、インスリンレセプターそのものに結合している可能性を見いだしているが、本年度中に証明できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究によって各週齢のWTとKOマウスから肝細胞を単離してきて培養することに成功し、MEFよりも肝細胞におけるGADD34の発現が強いことも確認できた。しかし、MEFや肝細胞の初代培養ではGADD34の発現が弱いことと、増殖が弱いためin vitroの実験で、免疫沈降を行う事が難しかった。そこで今後は、マウス肝細胞癌（Hepa1-6）やヒト肝癌由来細胞株（HepG2）に発現ベクターを使ってGADD34を強発現させて免疫沈降や免疫染色を行い、GADD34は細胞内のどこに発現し、インスリンシグナル伝達系のどの部位で働いているのかについて同定する。
その後、WTとKOマウスのMEFや肝細胞を用いてウェスタンや免疫染色によってこれらの同定を検証する。
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| Causes of Carryover |
本年度８月、当初予定通りに肝細胞を用いた解析を行い、MEF及び肝細胞を用いた免疫沈降の条件を検討してみたが、予定していた抗体では非特異的結合が多く、GADD34と結合するタンパクを検出できなかった。従って、より高い純度のGADD34の抗体の調整と発現ベクターを作製した上でCell lineの遺伝子操作を行ってGADD34の強発現をさせ、それらを用いた免疫染色や免疫沈降による解析が必要となったため、予定より10ヵ月程度の遅延が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
より高い純度のGADD34の抗体の作成と発現ベクターの作製を依頼し、マウス肝細胞癌（Hepa1-6）やヒト肝癌由来細胞株（HepG2）を購入し、遺伝子操作を行ってGADD34の強制発現をさせ、それらの細胞を用いて免疫染色や免疫沈降による解析を行う。
免疫染色では、GADD34の発現部位を抗体で特定し、免疫沈降ではGADD34と結合するタンパクを同定する予定である。
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