2014 Fiscal Year Research-status Report
GPCRのヘテロダイマー形成によるシグナル伝達制御機構の解明
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26870292
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
笠井 倫志 京都大学, 再生医科学研究所, 助教 (20447949)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | Gタンパク質共役型受容体 / ヘテロダイマー / ドーパミン受容体 / 3量体Gタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）のヘテロダイマーがシグナルユニットであるという仮説を検証する事である。そのために、生細胞中でのGPCRの蛍光ラベル法を検討した。タグ分子を結合させても、細胞膜に発現し、蛍光色素によるラベルが可能である事を、ドーパミン受容体D2を含む、４種類のGPCRで確かめた。
まず、蛍光1分子観察法を用いて、輝点の共局在時間を調べる事で、ホモダイマー形成について調べたところ、いずれの受容体についても、寿命が100ミリ秒未満の動的なホモダイマーを形成することが分かった。
次に、これらのGPCRのうち、同じ内在性リガンドに結合する3種類のGPCRのサブタイプを用いて、ヘテロダイマーを検出する実験を行った。任意の二つの組み合わせを用いて、二色同時蛍光1分子観察し、輝点同士の共局在時間から、分子同士の結合時間を見積もった。その結果、一組を除く組み合わせで、寿命約40ミリ秒の、短寿命で動的な、分子種選択的なヘテロダイマーが出来ていることが分かった。以上の、ホモダイマーや、ヘテロダイマー形成について得られた結果は、過去の生化学的な手法を用いて得られた結果とよく一致した。
さらに、輝点同士の共局在の解析方法を改良するために、次の二つを検討した。１）2色同時蛍光１分子観察して得られた画像での、輝点ペアの共局在を高精度で判定する方法、および、２）輝点分布の共局在の度合いを解析する、より高速で簡便な判定方法の検討である。特に２）については、輝点同士の距離の分布を調べる事で、従来よりも簡便に共局在の有無を判定できることが分かったので、以降の研究で用いる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2色同時蛍光1分子観察法を用いる事で、GPCRのホモダイマー、もしくは、ヘテロダイマー形成を検出する事が出来た。その結果、調べた4つのGPCRが動的なホモダイマーを形成していることが分かった。特に、同じアゴニストに結合する3種類のGPCRサブタイプでは、特定のサブタイプ間でのみ、動的なヘテロダイマー形成をすることも分かった。以上の結果から、蛍光1分子観察法を用いて、寿命40－100ミリ秒程度の、GPCRのホモダイマーおよび、ヘテロダイマー形成を観察できることが分かった。
2色同時蛍光1分子観察したデータの解析方法の検討も進めており、従来の共局在時間を調べるよりも、簡単に共局在の有無を判定する方法を確立した。
ドーパミン受容体については、D1受容体と、D2受容体のうち、D2受容体のラベル方法が確立している。一方で、D1受容体のラベル法はこれから検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、D1受容体の蛍光色素ラベル法を確立させる。そののち、蛍光1分子観察を行い、D1とD2とのヘテロダイマー形成を調べる。D1、D2にアミノ酸変異を導入して、ダイマー形成が阻害される様子を蛍光1分子観察して調べ、D1とD2のヘテロダイマー形成に必要な相互作用部位を同定する。また、1分子FRETなど、分子同士が直接相互作用している事を確かめるための手法も取り入れる。
GPCRのヘテロダイマー形成によって、１）アゴニストに対するアフィニティが変化する可能性、２）取り込みの制御が行われている可能性、３）結合する三量体Gタンパク質のサブタイプが変化する可能性が報告されている。これらを、１‘）蛍光アゴニストが、ヘテロダイマーに結合する様子を蛍光1分子観察し、ヘテロダイマーとモノマーでアゴニストの結合時間やオンレートが変化する様子を調べる事で検証する。また、２’）クラスリンなどの取り込み関連分子と受容体を同時に観察することで、ヘテロダイマーが、効率よくクラスリン被覆ピットに集積するかどうかを検証する。さらに、３‘）幾つかの異なる三量体Gタンパク質のサブタイプを用いて、ヘテロダイマーとの結合時間を調べ、ヘテロダイマーのシグナル機能を明らかにする。
さらに、ホモダイマーや、ヘテロダイマーだけでなく、さらに大きな分子複合体が混在状態として存在しているかどうかも検討する。すなわち、トライマー、テトラマー、さらに大きな分子会合体形成が起きる様子を蛍光1分子観察し、これらの分子複合体の混在割合を調べる。その後、異なるアゴニスト添加によって、混在割合の変化を調べ、ヘテロダイマーなど、分子複合体の生理的意義を解明するきっかけにする。
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