トロパン骨格の生合成に関与する酵素の構造機能研究および非天然型化合物群の創出

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26870425
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 田畑 香織(佐々木香織) 九州大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (90464388)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: トロパン骨格 / 生合成酵素 / 結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

ナス科植物であるダツラにはトロパン骨格を持つ薬理学的に重要な化合物が含まれている。中でもアトロピンやスコポラミンは抗コリン作用を示すことが知られており、散瞳や鎮痙、鎮痛薬として用いられている。これらの化合物はオルニチンをスターターとして合成されることが分かっており、いくつかのステップに関しては反応を触媒する酵素が同定されているが、トロピノンを合成するステップについてはポリケタイド合成酵素が関与すると考えられるものの、まだ明らかとなっていない。
そこで、大腸菌を用いてポリケタイド合成酵素の大量発現系を作製し、構造および機能を解明することを目的とし、研究を開始した。
まず、ダツラおよびハシリドコロ培養植物からtotal RNAを抽出し、逆転写によりcDNAを合成した。これを鋳型としてPCRおよび5’あるいは3’RACEを行い、ダツラより２種、ハシリドコロより２種の新規遺伝子のクローニングに成功した。
次に、得られた４種の新規遺伝子をそれぞれ大腸菌発現用プラスミドに組み込み、大腸菌での発現を検討したところ、可溶性画分に発現することが明らかとなった。発現させた組換えタンパク質についてNiアフィニティーカラムを用いて精製し、HPLCにより酵素活性の測定を行ったところ、ヘキサノイルCoAやN-methylpyrrolinium cationを基質とし、新たな化合物を生成していることが判明した。
今後は、得られた生成物に関してMSやNMRにより構造を決定する予定である。また、結晶化条件の検討も行う。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

８月より産休・育休を取得し、研究期間が４ヶ月しかなかったにもかかわらず、新規遺伝子のクローニングから大腸菌での発現系の構築、酵素活性の測定まで進めることができた。

Strategy for Future Research Activity

前年度検討した組換えタンパク質の発現条件をもとに、大量に調製し、酵素活性の再現性を確認する。
さらに、当初の計画通り、生成した化合物の構造決定および発現させた組換えタンパク質の結晶化を進めていく。

Causes of Carryover

８月より産休・育休を取得し、研究期間が４ヶ月しかなかったので、予定よりも研究費の使用が少なかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初の計画通り、得られた組換えタンパク質を精製するために、イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを購入する。また、結晶化条件検討のため、結晶化試薬および結晶化用プレートを購入する。
結晶が得られれば、放射光施設で測定を行うため旅費として使用する。