2015 Fiscal Year Research-status Report
特異的分子ツール設計法：プロテインキナーゼ指向型立体構造規制ペプチドライブラリー
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26870503
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
藤原 大佑 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (30611420)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ライブラリー / プロテインキナーゼ / ファージディスプレイ / ペプチド / 阻害剤 / オーロラキナーぜ / 細胞膜透過性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、プロテインキナーゼ（以下PK）を標的タンパク質とした特異的分子ツール（阻害剤）設計法の確立を目的とする。平成27年度では、先に作製したPK指向型マイクロ抗体ライブラリーを用いて、オーロラキナーゼA（以下AurA）選択的な阻害剤の創出を試みた。(1)最初に、AurA選択的に結合するファージクローンを得た。(2)次に、得られたファージクローンが提示するアデノシン修飾型マイクロ抗体を化学的に合成した。(3)さらに、合成したアデノシン修飾型マイクロ抗体について、AurA阻害活性ならびにAurA選択性を評価した。
1.ファージ表層提示法を基盤とするPK指向型マイクロ抗体ライブラリーを用いて、AurA選択的なファージクローンの獲得を試みた。まず、AurAを96ウェルプレートへ固定化し、固定化量依存的なキナーゼ活性を確認した。次に、このキナーゼ固定化ウェルにPK指向型ライブラリーを加えてスクリーニングを行った。その結果、AurA選択性クローンの優先的な増幅が見られた。任意に選んだクローンのDNA配列から、獲得したマイクロ抗体のアミノ酸配列を決定した。
2. 1.で得たマイクロ抗体Adc-Bip-3を合成した。まずFmoc固相合成法を用いてマイクロ抗体Bip-3を化学的に合成した。さらに、マレイミド化アデノシン反応させて、アデノシン修飾型マイクロ抗体Adc-Bip-3を得た。
3.Adc-Bip-3、Bip-3、ならびにアデノシンについてIMAP TR-FRET法によりAurAに対するキナーゼ活性阻害試験を行った。Adc-Bip-3のAurA阻害性が最も高かったことから二価阻害剤獲得とした。異なるキナーゼファミリーに対して同様に評価したところ、Adc-Bip-3が最もAurAを強く阻害した。
これらのことからPK指向型マイクロ抗体ライブラリーを用いたAurA選択的阻害剤の創出とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の平成27年度計画である、(1) PK指向型マイクロ抗体ライブラリーを使ったAurA選択的結合活性ファージクローンの獲得、(2)得られたマイクロ抗体の化学合成、ならびに、(3) AurAキナーゼ阻害活性とAurA選択性を評価した。これらのことから本研究課題はおおむね順調に進行しているとした。
1. PK指向型ライブラリーを用いて多数のAurA結合性クローンを得た。一般に、ペプチドライブラリーから分子標的阻害剤を得るのは極めて困難であるが、PK指向型マイクロ抗体ライブラリーを用いることで、AurA選択的に結合するファージクローンを迅速に得ることができた。得られたファージクローンのDNA配列からマイクロ抗体のアミノ酸配列を決定したところ、コンセンサスな配列が見られた。
2. 1.で最も出現頻度が高かったクローンが提示するマイクロ抗体Adc-Bip-3を化学的に合成した。最初にBip-3をFmoc固相合成法により合成してRP-HPLCにより精製した。一般にペプチドの合成効率はアミノ酸配列に依存する。Bip-3は約40残基と長鎖ペプチドにもかかわらず標準的な条件で十分量合成ができ、また十分な水溶性を有した。このBip-3に、システイン選択的なマレイミド基をもつアデノシンを加えたのちRP-HPLCにより精製し、アデノシン修飾型のAdc-Bip-3を得た。
3. IMAP TR-FRET法を用いてAdc-Bip-3のAurA阻害活性を調べた。Adc-Bip-3はBip-3に比べ、約10倍AurA阻害活性高かった。また、Bip-3の阻害様式をラインウィーバーバークプロットにより評価したところ、ATPと競合しなかった。すなわちBip-3はAurAのATP認識部位と異なる部位を認識することを明らかにした。これらの結果から、Adc-Bip-3はAurAを二価的に阻害することを明らかにした。
このように研究計画(1)-(3)を実施できたことから、本研究はおおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の当初計画に原則的にしたがい、Adc-Bip-3に対する細胞膜透過性の付与を目的とした研究を推進する。AurAは細胞内に存在する。AurA阻害剤Adc-Bip-3が効果を示すためには、阻害剤が細胞内へ移行する必要がある。当初は細胞膜透過性ペプチドの付与を計画していたが、研究手法を変更して研究目的の達成を試みる。まず(1)Adc-Bip-3の分子サイズを小さくする。さらに、 (2) 化学的に脂質二重膜透過性を評価する。最後に、(3)細胞透過性を評価する。
1. 胞膜透過性には一般的に分子サイズが小さいほうが有利である。そこでAdc-Bip-3のペプチド部位であるBip-3を低分子化する。二本のヘリックスからなるペプチドBip-3を、1本のヘリックスからなるsBip-3へ低分子化する。このとき、分子内架橋によってBip-3のC末端側ヘリックスのみをもつペプチドを設計して合成する。円二色性スペクトル測定による二次構造の確認と、IMAP TR-FRET法によるAurA阻害活性を確認する。
2. 次に、sBip-3ならびにAdc-sBip-3 の脂質二重膜透過性を評価する。生体膜由来成分を含むメンブレンフィルターを使った膜透過能を評価する。PAMPAアッセイなどの代表的な化学的手法を用いる。
3. 最後に、Adc-sBip-3を蛍光ラベルし、培養細胞を用いた細胞内移行能を評価する。フローサイトメーターをつかった細胞内取り込み量の定量的評価と、共焦点顕微鏡を用いた細胞内移行の観察実験を行う。
計画(1)-(3)に示したように、Adc-Bip-3の分子サイズを小さくすることで細胞膜透過性の付与を試みる(1)。Non-cell-basedアッセイによる脂質二重膜透過性の評価を新たに加え(2)、最後に培養細胞を用いた細胞膜透過性を評価する(3)。
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画に従い予算を執行したものの、試薬や備品の購入を通じて3円分の端数が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費とする。
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