2015 Fiscal Year Research-status Report
イオン液体耐性細菌のゲノム解読と耐性機構の解明、有用酵素の開発
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26870731
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
倉田 淳志 近畿大学, 農学部, 講師 (10416000)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | イオン液体 / Bacillus 属細菌 / イオン液体耐性 / 浸透圧ストレス / ゲノム解析 / [BMIM][Cl] |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高塩濃度環境は、通常の微生物には殺菌的な環境である。耐塩性細菌はこのような特殊な環境で生育する。本研究では、耐塩性細菌を活用して、新たな物質変換技術の開発を目的とする。イオン液体は常温で液体の有機塩であり、親水性イオン液体と疎水性イオン液体に分類できる。現在、イオン液体を溶媒として化学製品群、医薬品などの生産技術が開発されつつある。我々は、親水性イオン液体[BMIM][Cl]耐性・耐塩性Bacillus amyloliquefaciens CMW1を独自に発見している。そこで、本菌株と酵素の[BMIM][Cl]耐性機構の解明、さらに耐性酵素の開発を目的とした。
現在まで、Bacillus属細菌のイオン液体耐性機構は不明である。そこで、H26年度には本菌株のゲノムDNAを解読し、タンパク質をコードする遺伝子 9175 個を見いだした。さらにイオン液体耐性Enterobacter lignolyticus SCF1との遺伝子の比較、さらに補償溶質添加培養実験によって、B. amyloliquefaciens CMW1の[BMIM][Cl]耐性には、浸透圧に対する応答が関与していることを示した。
H27年度には、B. amyloliquefaciens CMW1がコードするイオン液体耐性プロテアーゼ（BapIL）遺伝子を単離した。さらに本酵素の大量生産条件と本酵素の精製条件を検討した。その結果、新規な親水性イオン液体[BMIM][Cl]耐性プロテアーゼを精製酵素画分として得ることができた。これに加えて、D-アラニン-D-アラニンリガーゼ（DDL）遺伝子、抗菌ペプチド遺伝子（BacIId）を見いだして、異種発現系を構築できた。
以上の研究実績は、各種学会にて報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、すでに親水性イオン液体[BMIM][Cl]耐性・耐塩性Bacillus amyloliquefaciens CMW1を独自に見いだしている。さらに本菌株は、[BMIM][Cl]存在下で、良好なタンパク質分解活性を示した。昨年度にゲノム解読を行っているため、本年度は本菌株から有用遺伝子の探索を試みた。具体的には、タンパク質の代謝経路に注目して、イオン液体耐性プロテアーゼ遺伝子（BapIL）、D-アラニン-D-アラニンリガーゼ（DDL）遺伝子、抗菌ペプチド遺伝子（BacIId）を見いだした。BapILは精製を行い、諸性質を解明した。DDLとBacIId は、異種発現系を構築できた。研究成果は、各種学会にて報告できたことから、判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
親水性イオン液体[BMIM][Cl]は、難水溶性バイオマスを溶解できるため有用性が高い。しかし、低濃度で大腸菌や枯草菌の生育を阻害し、酵素を変性および失活させる。そのため、既存の菌株からの[BMIM][Cl]耐性酵素の探索は困難であり、高濃度[BMIM][Cl]耐性酵素は未開発である。これまで本研究では、親水性イオン液体耐性B. amyloliquefaciens CMW1のイオン液体耐性について検討した。さらに、ゲノムDNAを解読し、多数の酵素遺伝子を見いだした。そこで今後は、イオン液体耐性を示すプロテアーゼ、D-アラニン -D-アラニンリガーゼなどを用いて、酵素のイオン液体耐性を解明する。以上から、当初の目的である、本菌株と酵素の[BMIM][Cl]耐性機構を解明し、さらに耐性酵素の開発を行う。
これに加えて、親水性イオン液体耐性B. amyloliquefaciens CMW1のゲノム情報の有効活用を目的として、遺伝子配列から推定した新規な抗菌ペプチドの活性検出を試みる。
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Research Products
(4 results)
