2014 Fiscal Year Research-status Report
CRISPR/Cas9システムによる時期および組織特異的遺伝子機能解析法の開発
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26870845
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
太田 聡 山梨大学, 総合研究部, 特別研究員(PD) (60553310)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ゼブラフィッシュ / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / トランスジェニック / コンディショナルノックアウト / Gal4-UAS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちは以前にゲノム編集技術TALENをゼブラフィッシュに対して最適化することに成功していたが、2013年、CRISPR/Cas9という新規ゲノム編集技術が発表された。私たちはCRISPR/Cas9とGal4-UAS系を組み合わせることにより、時期・組織特異的なゲノム編集を可能にすることを目指している。
1. まず、私たちもCRISPR/Cas9のゼブラフィッシュへの最適化に取り組んだ。そして、CRISPR/Cas9は単なる遺伝子破壊だけでなく、複数遺伝子の同時破壊や染色体欠失・逆位の誘導にも適していることを明らかにした。以上についてはGenes to Cells誌に報告した。
2. CRISPR/Cas9において、標的遺伝子を規定するのは短鎖guide RNAである。したがって、恒常的にヌクレアーゼCas9を発現するトランスジェニック系統を作製すれば、guide RNAの微小注入だけで遺伝子改変が行えると考えられる。私たちはまず、UASプロモーターの制御下でCas9を発現する系統を作製した。Cas9遺伝子の下流にはin frameでmCherryが組み込まれており、Cas9トランスジェニック同定しやすいように工夫した。全身でGal4を発現する系統とCas9トランスジェニック系統の掛け合わせから得られた受精卵に、既に機能することが分かっているtyrosinase-guide RNAを注入したが、tyrosinase遺伝子座は切断されなかった。おそらく、Cas9の発現が機能的なレベルまで達していなかったと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Cas9を恒常的に発現しているトランスジェニック系統を作製したはずだったが、guide RNAを注入しても、標的遺伝子座は切断されなかった。Cas9が機能的なレベルまで発現していない可能性としてCas9とmCherryを融合タンパク質で発現させた可能性が考えられた。したがって、Cas9のインディケーターとして別々の転写産物としてmCherryを発現するCas9トランスジェニックを作製した。しかしながら、このCas9トランスジェニックにおいても、guide RNAの注入だけでは標的遺伝子座が切断されなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas9によるコンディショナルノックアウト動物の作製は他のグループに報告されてしまったため、研究計画を変更する。CRISPR/Cas9は単なる遺伝子破壊だけでなく様々なアプリケーションに利用可能な技術であるので、次年度はCRISPR/Cas9の新たな利用法について開発を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
効率よくCas9を発現するトランスジェニックフィッシュが作製できなかったので、その後の解析を行うことができなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
分子生物学実験における消耗品の購入に使用する予定。
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