部位特異的かつ多部位への非天然型アミノ酸導入による新規タンパク質安定化法の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26870853
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 大竹 和正 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 特別研究員 (80593631)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 応用生物化学 / 酵素化学 / 非天然型アミノ酸 / タンパク質工学 / 生体分子の化学修飾 / バイオテクノロジー / タンパク質の安定化 / 拡張遺伝暗号

Outline of Annual Research Achievements

申請者らは、大腸菌翻訳終結因子1遺伝子破壊株(RFzero株)を作成することに成功しており、本株を用いることによりタンパク質中の部位特異的多数箇所に自在に非天然型アミノ酸を導入することを可能にしている。本申請課題ではRFzero株を用いてハロゲン化チロシンをタンパク質中の多数箇所に導入し、タンパク質を安定化する手法の開発に成功した。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)中の七箇所のチロシン残基を3-ブロモチロシンもしくは3-クロロチロシンに置換することにより顕著に耐熱化した変異体を取得することが出来た。また、X線結晶構造解析によりこれら変異体の構造を高分解能で明らかにした。この三次元構造を基にした量子化学的計算を行い、ハロゲン原子がタンパク質中の空隙を埋めることによるvan der Waals相互作用の変化がタンパク質安定化の主因であることを明らかにした。そこで、PDBに登録されている既存構造を用いてタンパク質中のチロシン残基meta位相当部位の空隙のサイズを計算したところ、約四分の一が臭素原子または塩素原子の導入によりvan der Waals相互作用を形成させるのに適したサイズであることが判明した。このことから本手法はGSTのみならず幅広く他のタンパク質にも応用可能であることが示唆された。実際にアゾレダクターゼ中の三箇所にブロモチロシンを導入することにより大幅に耐熱化した変異体の作成に成功した。
本研究で申請者らは、部位特異的多数箇所に非天然型アミノ酸を導入する独自技術を利用し、ハロゲン原子をタンパク質中へと導入し安定化する手法の開発に成功した。本法は従来の進化工学的なタンパク質工学手法とも組み合わせて利用可能であり、酵素を初めとする産業上重要なタンパク質の改変における新たな可能性を切り拓くものである。

Research Products

• [Journal Article] Incorporation of a Doubly Functionalized Synthetic Amino Acid into Proteins for Creating Chemical and Light-Induced Conjugates (2016)
  • Author(s): Yamaguchi, A.; Matsuda, T.; Ohtake, K.; Yanagisawa, T.; Yokoyama, S.; Fujiwara, Y.; Watanabe, T.; Hohsaka, T.; Sakamoto, K.
  • Journal Title: Bioconjugate Chemistry Volume: 27 (1) Pages: 198-206
  • DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00602
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 新規アミノ酸の導入によるタンパク質の安定化技術 (2016)
  • Author(s): 大竹和正、坂本健作
  • Journal Title: バイオサイエンスとインダストリー Volume: 74(1) Pages: 34-36
• [Journal Article] Protein stabilization utilizing a redefined codon (2015)
  • Author(s): Ohtake, K., Yamaguchi, A., Mukai, T., Kashimura, H., Hirano, N., Haruki, M., Kohashi, S., Yamagishi, K., Murayama. K., Tomabechi, Y., Itagaki, T., Akasaka, R., Kawazoe, M., Takemoto, C., Shirouzu, M., Yokoyama, S. & Sakamoto, K.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 5 Pages: 9762
  • DOI: 10.1038/srep09762
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Highly reproductive Escherichia coli cells with a blank assignment for the UAG codon (2015)
  • Author(s): Mukai, T., Hoshi, H.; Ohtake, K., Takahashi, M., Yamaguchi, A., Hayashi, A., Yokoyama, S. & Sakamoto, K.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 5 Pages: 9699
  • DOI: 10.1038/srep09699
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Reassignment of a rare sense codon to a non-canonical amino acid in Escherichia coli (2015)
  • Author(s): Mukai, T., Yamaguchi, A., Ohtake, K., Takahashi, M., Hayashi, A., Iraha, F., Kira, S., Yanagisawa, T., Yokoyama, S., Hoshi, H., Kobayashi, T., Sakamoto, K.
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 43(16) Pages: 8111-8122
  • DOI: 10.1093/nar/gkv787
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 大腸菌コドン再定義株を用いた二種非天然型アミノ酸同時導入法の開発 (2016)
  • Author(s): 大竹 和正、春名 健一、坂本 健作
  • Organizer: 日本農芸化学会2016年度大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター・札幌市・北海道
  • Year and Date: 2016-03-30 – 2016-03-30
• [Presentation] 大腸菌コドン再定義株がもたらす新たなタンパク質工学の展開 (2015)
  • Author(s): 大竹 和正、山口 純、春名 健一、坂本 健作
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド・神戸市・兵庫県
  • Year and Date: 2015-12-02 – 2015-12-02
• [Presentation] In vivo engineering of the genetic code with synthetic amino acids (2015)
  • Author(s): 坂本 健作、大竹 和正、山口 純、向井 崇人
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会 第88回日本生化学会大会 合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド・神戸市・兵庫県
  • Year and Date: 2015-12-02 – 2015-12-02
• [Presentation] DNA 情報をタンパク質に変換するルールの人為的な改変と蛋白工学への応用 (2015)
  • Author(s): 坂本 健作、大竹 和正
  • Organizer: 第67回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 城山観光ホテル・鹿児島市・鹿児島県
  • Year and Date: 2015-10-28 – 2015-10-28