2014 Fiscal Year Annual Research Report
新規免疫素子Q-bodyを用いたClaudinの生細胞イメージング
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26889028
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
鄭 煕陳 東京工業大学, 資源化学研究所, 特任助教 (70737981)
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| Project Period (FY) |
2014-08-29 – 2016-03-31
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| Keywords | 蛋白質工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度の研究目標は、Claudin認識Q-bodyの遺伝子を構築し，蛋白質合成および色素修飾を行うことであった．特に，各段階において反応条件の最適化を行い，蛋白質の収量と修飾効率の最大化を試みた．具体的には，
1) Claudin認識Q-bodyの発現遺伝子の構築: 大阪大学大学院薬学研究科近藤昌夫准教授の研究グループからClaudin認識抗体遺伝子をご提供いただき，そのClaudin認識抗体のVHおよびVLを，当研究グループで開発された大腸菌細胞内Fab発現ベクターpUQ2に挿入することに成功した．pUQ2ベクターは，H鎖とL鎖それぞれのN末付近に蛍光色素修飾用のシステイン(Cys)残基が含まれたCysタグが付加されており，ダブルで色素を修飾することが可能となる．なお，C末付近にはHisタグとFlagタグが付加されており，Q-bodyの精製が容易になるという特徴を持つ．
2) 蛋白質の合成および精製: 作成した遺伝子で大腸菌SHuffle T7 express lysYを形質転換し，Fab断片を発現させた．その後，細胞質画分を回収し，Talonコバルトアフィニティカラムを用いて精製を行った．その結果，高純度で、正しくフォールディングされた可用性蛋白質を得ることに成功した．
3) 蛍光色素修飾: TCEPゲルを用いてCysタグ中のCys残基を還元させ，蛍光色素ATTO520-マレイミド, R6G-マレイミド, TAMRA-マレイミドでそれぞれ修飾を行った．その後，抗Flag抗体アガロースゲルを用いて遊離の色素を除去した．SDS-PAGEにてH鎖，L鎖両方とも修飾されたことを確認した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Claudin認識抗体からQ-bodyを作製することを目標としていた．その結果，可用性の蛋白質が得られ，蛍光色素の修飾も正確に行われたので，おおむね順調に進展していると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに得られた結果を基にして，次の 2 つの課題を考えることで研究を推進させていく．
1) クエンチ度の評価，経時変化，Claudin検量線の作製を含めたQ-bodyの蛍光強度の測定
2) Claudin発現細胞HT1080を培養し，蛍光顕微鏡にてQ-body添加後の蛍光変化を観察する．
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