副腎皮質球状層単離法の確立とそれを応用したCYP11B2遺伝子発現制御機構の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26893012
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 伊藤 亮 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80733815)
• Project Period (FY): 2014-08-29 – 2016-03-31
• Keywords: 内分泌 / 発現制御 / プロテオーム

Outline of Annual Research Achievements

本年度の研究において、CYP11B2遺伝子座にGFP (Green fluorescent protein)遺伝子を組み込んだBAC (Bacterial artificial chromosome)を作製した。CYP11B2遺伝子座へのGFP遺伝子の組み込みは、PCR反応、シーケンシング解析、ササンブロッティング解析により確認した。作製したBACをマウス受精卵にマイクロインジェクションし、トランスジェニック (Tg)マウスを作出した。ジェノタイピング解析の結果、体細胞にGFP遺伝子を持つマウスを得ることができた。今後、生殖系列細胞への導入、及び副腎皮質球状層細胞における特異的なGFP発現を検証していく必要がある。
また、副腎皮質腫瘍由来H295R細胞を用い、アンジオテンシンII (Ang II)により引き起こされる核内イベントの網羅的解明を試みた。その方法には、SILAC (Stable Isotope Labeling using Amino acids in cell Culture)法によるプロテオーム解析を用いた。検討実験の結果、より詳細に核内イベントを解析するには全細胞抽出液を用いるのではなく、塩濃度による細胞質・核分画を実施する必要があることがわかった。分画を行った核抽出液を用いてプロテオーム解析を行った結果、いくつかの新規Ang II応答遺伝子を明らかにした。次年度では、これらの応答因子のCYP11B2遺伝子発現に対する影響の有無を検証する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度ではCYP11B2遺伝子座にGFP遺伝子を挿入したBACを作製することができた。さらに、そのBACをもとにしたTgマウスを作出することに成功した。また、培養細胞を用いた実験から、新規Ang II応答因子群を同定することができた。

Strategy for Future Research Activity

得たTgマウスを用い、速やかに球状層細胞の単離を行う。さらに、つくば高血圧マウスとの交配により得た球状層細胞を用いプロテオーム解析を行い、培養細胞で得た結果との比較を行う。また、新規Ang II応答因子群のCYP11B2遺伝子発現への影響を評価する。