ショウジョウバエVNUTの同定とその生理的意義

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26893154
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 加藤 百合 岡山大学, 学内共同利用施設等, 助教 (10732042)
• Project Period (FY): 2014-08-29 – 2016-03-31
• Keywords: 小胞型ヌクレオチドトランスポーター / ATP / 化学伝達

Outline of Annual Research Achievements

プリン作動性化学伝達は高次精神活動や感覚受容など多彩な生理作用に関与している。小胞型ヌクレオチドトランスポーター（Vesicular nucleotide transporter, VNUT）は分泌小胞中へのATPの濃縮を担い、プリン作動性化学伝達の必須因子である。しかし、VNUTの個体レベルでの生理的役割はよくわかっていない。本研究計画では、遺伝子操作が容易なモデル生物であるショウジョウバエに着目し、ショウジョウバエVNUTを同定し、その生理的意義を解明することを目的とする。
候補トランスポーターを昆虫細胞に大量発現させ、膜画分を可溶化し、精製した。これを人工膜小胞に再構成し、ATP輸送活性測定した。その結果、ヒトVNUTと同様に、膜電位差を駆動力とし、塩素イオン依存的にATPを輸送した。この輸送活性はVNUTの阻害剤であるDIDSやEvans blue により完全に阻害された。競合阻害実験により、このトランスポーターはATPだけではなく、ADPやGTP、UTPなど幅広いヌクレオチドを認識することを明らかにした。この候補トランスポーターの局在を解析するために、特異的抗体を作製し、精製した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ショウジョウバエVNUTのタンパク質レベルでの機能解析は全て完了した。
また、ショウジョウバエVNUT特異的抗体を精製し、ショウジョウバエにおけるVNUTの局在解析の準備が整った。
以上のように、研究は順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

精製したショウジョウバエVNUT特異的抗体を用いてショウジョウバエの各ステージにおけるVNUTの発現と局在を明らかにする。
また、作製したVNUTノックアウトショウジョウバエと野生型ショウジョウバエとで、プリン作動性化学伝達の関与が考えられる行動を比較し、解析する予定である。