副腎低形成症における新規原因遺伝子の同定とその分子機能の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26893259
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 天野 直子 慶應義塾大学, 医学部, 共同研究員 (70348689)
• Project Period (FY): 2014-08-29 – 2016-03-31
• Keywords: 小児内分泌 / 発生分化 / 副腎

Outline of Annual Research Achievements

①微細欠失を同定した2症例の切断点同定：切断点同定が不可能な1例について、想定領域周囲にプローブを密に設定したカスタムアレイを作成し、アレイCGH解析を行った。カスタムアレイCGHの結果、切断領域を、58.5kb-61.0kbまで絞り込むことに成功した。再度、この結果を参考に、プライマーを設計し、切断点同定を試みる予定である。
②微細欠失により産生されるmRNAの配列確認：患者と対照由来のリンパ芽球から抽出したmRNAの配列確認を試みた。昨年度（平成26年度）は該当領域をPCRで増幅できず、配列を確認できなかった。今年度（平成27年度）、再度プライマーを数か所に作成し、酵素および酵素反応条件を複数検討した。結果、該当箇所をPCRで増幅することに成功した。シークエンス反応で配列を確認した結果、微細欠失を有する2症例ともに同じエクソンを欠失した。尚、対照においては同様のエクソン欠失を検出しなかった。
③野生型遺伝子A発現ベクターを用いた機能解析：野生型遺伝子A発現ベクターとルシフェラーゼ発現ベクター（TCF/LEFレポーター）をLipofectamine2000で培養細胞（HEK293など）に導入し、ヒトWnt3aとヒトRSPO1を培養液中に添加後、ONE-GLO reagentを添加し、蛍光強度を定量した。結果、野生型では空ベクターと比較し、蛍光強度（βカテニンシグナル）は著しく低下した。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。