歯胚再生技術を用いたGFP陽性接合上皮細胞の単離による特異的遺伝子発現の解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26893274
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 氷室 沙羅 昭和大学, 歯学部, 助教 (90736513)
• Project Period (FY): 2014-08-29 – 2016-03-31
• Keywords: 接合上皮 / 再構成歯胚

Outline of Annual Research Achievements

当該年度では、(1)GFPで標識された接合上皮の作製とその単離、(2)酵素処理を用いた接合上皮細胞の分散化を目的とした。
実体顕微鏡を用い、胎生15日のGFPマウスと同齢の野生型マウスから歯胚を摘出し、それぞれの歯胚をディスパーゼ処理し、歯原性上皮組織と間葉組織に分離、GFPマウス歯胚の歯原性上皮組織と野生型マウスの間葉組織をコラーゲンゲル内で再構成し、37℃4日間器官培養して、再構成歯胚を作製した。移植3週前に、レシピエントとして、ソムノペンチル麻酔下で3週齢の野生型マウスの上顎第一第臼歯を抜歯した。抜歯窩の治癒を確認後、同様に麻酔下で歯胚を埋入した。具体的には、口蓋側に切開線を引き、歯肉を剥離翻転、直径、高さ１ミリの移植窩を形成、歯胚の上皮側をメチレンブルーにて染色し、移植の方向性を確認後、歯胚を埋入後、歯肉を元の位置に戻し、縫合した。接合上皮の回収時期は、萌出完了の移植後50日とした。頸椎脱臼にてマウスを屠殺後、上顎を分離し、頬粘膜をトリミングした。蛍光実体顕微鏡下で、上顎第一第臼歯相当部に萌出した再構成歯近傍の接合上皮と口腔上皮を回収した。回収した組織は1.25U/mL ディスパーゼで処理後、結合組織と分離した。その後、0.25%トリプシン・50U/mLコラゲナーゼを用いた酵素反応液にて処理し、上皮細胞を分散化した。
次年度では、フローサイトメトリーを用いたGFP陽性接合上皮細胞の採取、cDNA microarrayを用いた発現遺伝子の網羅的解析、免疫組織化学による接合上皮特異的発現因子の局在解析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

GFP陽性歯原性上皮・野生型C57BL/6マウスの間葉組織の再構成歯胚の作製、再構成歯胚の移植、GFPで置換されたマウス接合上皮を外科的に単離、酵素処理を用いた接合上皮細胞の分散化といった各ステップは、順調に実施せ来ているが、移植数が不足しており、フローサイトメトリーに十分な細胞数が確保出来ていない。

Strategy for Future Research Activity

再構成歯の移植を継続して行い、細胞数が十分に達した所で、フローサイトメトリーを用いたGFP陽性接合上皮細胞の採取、cDNA microarrayを用いた発現遺伝子の網羅的解析、免疫組織化学による接合上皮特異的発現因子の局在解析を行う予定である。