カルモジュリン-カルモジュリン結合蛋白質相互作用の動的過程の解析

1985 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 60123009
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 山本 啓一 順天堂大学, 医, 講師 (70053361)
• Keywords: カルシウムイオン / カルモジュリン / 化学架橋

Research Abstract

一般細胞において外界からの信号はカルシウムイオン濃度の増加として細胞内に伝わる。 細胞内のカルシウムイオン濃度は元々非常に低いので、上昇したとしても【10^(-5)】M程度にしかならない。 このように低い濃度でもカルシウムイオンを強く結合し、それによっておこった構造変化によって種々の酵素の活性を調節する蛋白質がカルモジュリンである。 カルモジュリンは分子量17000の小さな蛋白質であるが多種の蛋白質と相互作用する。 カルモジュリン上の相互作用部位は相手によって異なるのか、それとも同一部位がすべての蛋白質と相互作用するのかという点と、その相互作用の速さが細胞内での生理的諸反応の速度にみあうだけ速いかという点を明らかにすることが我々の研究の目的である。 方法としては化学試薬による架橋反応を用いた。 カルモジュリンは牛の脳より調製し、カルモジュリン結合蛋白質としてはニワトリ砂のうより調製したミオシン軽鎖キナーゼを用いた。 まず、サクシニミジル-2-(m-アジド-O-ニトロベンズアミド)エチル-1,3′-ジチオプロピオネイトでカルモジュリンのリジン残基を修飾し、ストップトフロー装置によってミオシン軽鎖キナーゼと混合した後、時間をずらして閃光を当てそれによって起った架橋量から両者の複合体形成速度を測定した。 その結果、混合後100ミリ秒ですべてのカルモジュリンはミオシン軽鎖キナーゼと複合体をつくることが分り、細胞の生理的な応答に十分なほど速いことが明らかになった。 カルモジュリンとカルモジュリン結合蛋白質との相互作用部位については、蛋白質同志が接触しているところでのみ架橋反応を起す水溶性カルボジイミドを用いて調べた。 カルモジュリンとミオシン軽鎖キナーゼはこの試薬によって架橋されることが分ったので、その部位をペプチドマップ法によって調べている。