酵素機能の動的解析

1985 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 60430027
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 廣海 啓太郎 京都大学, 農, 教授 (50025425)
• Keywords: 酵素 / グルコアミラーゼ / 化学修飾 / 基質特異性 / アミノアシルtRNA合成酵素 / 蛋白質蛍光 / プロテアーゼ・インヒビター / ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒビター(SSI)

Research Abstract

1.Rh.niveusの生産するグルコアミラーゼの活性部位のサブサイトNo.3にあるトリプトファン残基(Trp)の修飾による基質特異性改変を目的として、Koshland試薬(HNB)による修飾を試み、これをグルコノラクトン等の阻害物質共存下においても行った(防ぎ修飾)。分子の大きさからは十分に活性部位に接近できる筈であるにも拘わらず、HNBは活性部位Trpを修飾し得なかった。これはHNBの分子的特性によると考えられるが、グルコアミラーゼ活性部位の化学的特性を解明するに当たって、HNBが一つの探索子となる可能性が示唆された。
2.中等度好熱菌B.stearothermophilusのL-バリン特異的アミノアシルtRNA合成酵素(VRS)をDISC電気泳動的に単一にまで精製した。精製VRSとアミノ酸およびATPとの結合を、平衡透析法ならびにVRS中のTrp由来の蛍光変化を指標とする蛍光滴定法により測定し解析した。L-バリンとATPはいわゆるランダム機構でVRSと結合するが、ATPが結合することによりVRSのアミノ酸選択性が厳しくなることが示され、本酵素がもつ高い基質特異性の発現機構の一端が明らかとなった。
3.放線菌の一種が生産する蛋白性プロテアーゼ・インヒビターであるStreptomyces subtilisin inhibitor(SSI)の酵素との反応部位ペプチド結合(Met73-Va174)を特異的に酵素作用により切断した分子種(修飾SSI)を調製し、電気泳動的に単一にまで精製した。修飾SSIは酵素ズブチリシンBPN'と結合し、この際、Met73-Va174結合は復元すると考えられる。修飾SSIとズブチリシンBPN'との結合を酵素の加水分解作用に対する阻害度を指標として測定し、平衡論的に解析し、非修飾SSIの場合と比較検討した。

Research Products

• [Publications] 日本農芸化学会大会講演要旨. (1985)
• [Publications] 生化学. 57-8. (1985)
• [Publications] 13TH INT'L.CONGR.OF BIOCHEM.ABST.TU-C-16-5. (1985)
• [Publications] 日本農芸化学会大会講演要旨. (1986)