1985 Fiscal Year Annual Research Report
ハイブリド酵素(ナイロンオリゴマー分解酵素EIIとその進化起源酵素間の)作成と性質
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60440007
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡田 弘輔 大阪大学, 工, 教授 (20028947)
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| Keywords | ナイロンオリゴマー分解酵素 / ハイブリド酵素 / 蛋白質工学 |
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| Research Abstract |
1. 酵素蛋白質のアミノ酸配列と機能との関係を理解することは、蛋白質工学の最重要課題である。既存の蛋白質中のアミノ酸残基を置換してその機能を変化させる場合、蛋白質の3次構造に関する知見を持たない限り、全アミノ酸残基について行なう必要があり、膨大な実験量が必要となる。6-アミノカプロン酸鎖状2量体加水分解酵素E【II】と、その進化起源と思われる酵素E【II】′は、いずれも392アミノ酸残基より成り、免疫的に交叉反応を示すが、基質鎖状2量体に対しては、E【II】はE【II】′の100倍の活性がある。本研究では、両者間の対応する領域を交換したハイブリド酵素を作成し、その性質変化を調べた。 その結果、活性増加、耐熱性や基質特異性の変化に寄与したと推定されるアミノ酸置換を含む領域を決定できた。
2. E【II】,E【II】′酵素のN末端側からそれぞれ 25,162,257,380番目のアミノ酸に相当する位置に、Pva【II】,Bgl【II】,SalI,BamH【I】部位が存在するので、これらの部位で相互に組み替え、ハイブリド酵素を作成した。E【II】′酵素のBgl【II】-Sal【I】間(領域【III】,チアミノ酸の相違)がE【II】側に置換した酵素(Hyb-12)では活性がE【II】′の約5倍に上昇した。 又E【II】′の領域【III】及びSal【I】-BamH【I】間(領域【IV】,15アミノ酸の相違)が E【II】側に置換した酵素(Hyb-10)では、さらに20倍の活性上昇が認められた。これらの結果から、高活性の発現には、領域【III】,【IV】の両者が必須である事がわかった。50℃での各酵素の不活化の経時変化を調べたところ、Hyb-10,Hyb-12の熱失活速度定数は、E【II】のそれぞれ2倍,4倍であり、熱安定性は低下していた。又、鎖状2量体類似基質(6-アミノヘキサノイルアニリン等)に対する基貭特異性を検討した結果、Hyb-10はE【II】と良く似ており、Hyb-12はE【II】′と似た特異性を示した。
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