実験的ぶどう膜炎の凍結組織切片におけるリンパ球サブセットのカラー画像解析

1985 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 60440081
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 小山 鉄郎 岡山大学, 医, 講師 (50135993)
• Keywords: 網膜S抗原 / ぶどう膜炎 / リンパ球サブセット / 画像解析

Research Abstract

1.ウシ網膜S抗原の精製: 網膜は低張処理をおこなって可溶性成分を溶出させ、硫酸アンモニウムにより塩析し、沈渣を溶解した。遠心分離ののち上清をG200 Sepnadexにかけ、SDS-ゲル電気泳動により分子量50,000前後のS抗原分画を同定し、濃縮したのち、さらに線形勾配(0.01-0.2M)のリン酸緩衝液をもちいた吸着カラムクロマトグラフィーによってS抗原を純化した。回収率は約1/7670であった。
2.網膜S抗原によるラットの実験的ぶどう膜網膜炎の作成: 近交系Lewisラットの後足蹠に、完全アジュバントと共に網膜S抗原1microgramを接種した。炎症の各時期に眼球を摘出し凍結切片とした。
3.モノクローナル抗体によって分別されるリンパ球サブセットのimmunoperoxidase法による染色: 凍結切片をブロッキング試薬(正常ヤギ血清)で処理した後、第1次抗体としてマウスの抗ラットモノクローナル抗体(MCA45,MCA48,MCA52,MCA54,MCA55,Serotec Limited製造)を反応させた。次に第1次抗体のF.o部分に第2次抗体(ヤギの抗マウス1gG)を反応させた。最後に第2次抗体のFab部分に標識抗体(ペルオキシダーゼ標識マウス免疫グロブリン)を20分間反応させ、AEC基質を発色させた。
4.カラー画像解析のプログラミング:赤色ないし赤褐色の標識はリンパ球細胞膜に表われるので、これを画像解析装置により自動計測させるプログラムを開発した。このプログラムは顕微鏡の自動ステージを制御し、全視野の標識された細胞を、もれなくかつ重複なく処理するが、標識された細胞の認識には若干の手動操作が加わった。
5.結果:実験的ぶどう膜網膜炎の発症の初期にはTヘルパー・インデューサー細胞とTサプレッサー・キラー細胞が同程度にみられ、いずれも中期にその数を増し、後期には、減少した。la抗原陽性細胞はいずれの時期にも動員された。現在詳細な解析が進められている。